基质金属蛋白酶2、整合素-金属蛋白酶17及上皮性钙粘附蛋白E在结直肠癌癌组织中的表达及临床意义

徐辉 唐言华 刘继武 王亮

贵阳市第一人民医院胃肠外科（贵阳550002）

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食道癌，随着我国人口老年化加剧，其发病率也在逐渐增加。由于结直肠癌发生部位较为隐蔽，使得大部分结直肠癌患者确诊时多为中晚期且常伴有转移，患者5 年生存率较低。随着对结直肠癌早期筛查诊断的深入研究以及靶向药物的应用，患者治愈率明显提高，生存情况明显改善［1-2］。因此，深入了解结直肠癌发生、发展以及转移过程中的分子机制，为结直肠癌早期诊断与治疗提供可靠依据具有重要意义。基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）家族中的重要成员，可降解细胞外基质和基底膜，促进肿瘤细胞浸润、转移［3-4］。研究表明，MMP-2 在结直肠癌进展、转移过程中发挥重要作用，结直肠癌中MMP-2 表达高于相邻正常黏膜［5］。整合素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17）是一种具有蛋白剪切酶样作用的糖蛋白，可水解释放多种配体，参与细胞信号转导，介导肿瘤发生发展与转移途径［6］。DENG 等［7］研究表明，ADAM17 能够促进结肠癌发生，可能成为结肠癌治疗中的药物靶点。上皮性钙粘附蛋白E（E-cadherin）作为钙粘蛋白家族的重要成员，可稳定细胞骨架及用于维持细胞-细胞间的相互作用，在完全分化的癌组织中，E-cadherin 高度表达，且肿瘤细胞侵袭、转移性降低，患者预后良好［8］。文献资料报道显示，细胞膜E-cadherin 表达减少预示着结直肠癌患者生存率低下［9］。为进一步研究MMP-2、ADAM17 和E-cadherin 在结直肠癌中的临床意义，本研究通过探讨MMP-2、ADAM17 及Ecadherin 在结直肠癌与癌旁组织中的表达情况，并分析其与结直肠癌临床病理特征间的关系以及与结直肠癌预后的关系，并分析MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 之间相关性，旨在为结直肠癌分子靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集我院2011年1月至2014年1月结直肠癌手术患者的新鲜标本（包括癌组织与距肿瘤至少5 cm 的癌旁组织）以及对应的石蜡切片组织210 例，其中男116 例，女94 例，年龄41 ～80 岁，平均（59.02 ± 10.36）岁。TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期137 例，Ⅲ、Ⅳ期73 例。纳入标准：（1）所有患者病理确诊为原发性结直肠癌；（2）均为首发病例；（3）术前均未接受新辅助化疗。排除标准：（1）合并其他部位原发性肿瘤患者；（2）排除肺转移、腹膜转移者；（3）临床资料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色所有标本连续切片，经脱腊水化后，加H2O2室温孵育20 min，再用PBS 漂洗3 min，滴加血清封闭1 h，加一抗4 ℃冰箱孵育过夜，PBS 漂洗，甩干滴加二抗，室温孵育30 min，洗去二抗，滴加DAB 显色，清水冲洗，苏木精染核5 min，冲洗，分化液分化1 s，流水冲洗5 min，梯度酒精复水，用中性树胶封片。结果判定：MMP-2、ADAM17 主要表达于细胞质，细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞；E-cadherin 主要表达于细胞膜，细胞膜上出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据着色细胞占视野细胞总数的百分比以及着色细胞染色强弱评分的乘积综合评分。

1.2.2 Western blot 检测MMP-2、ADAM17 及Ecadherin 蛋白表达提取结直肠癌组织以及对应的癌旁组织，操作严格按步骤进行，用BCA 法测定蛋白浓度进行蛋白定量，依照目标蛋白分子大小制定不同浓度分离胶，将配置好的胶板安置到电泳槽内，上样电泳，电泳完成后进行转膜、封闭、杂交，在电子凝胶成像系统下显影、拍照，以β-actin为内参蛋白，运用Image J 软件分析条带灰度值，以目的条带的灰度值/内参条带的灰度值表示蛋白相对表达量。

1.3 随访情况采用门诊方式随访5年，至2019年1 月，第1 年每3 个月随访一次，2 ～5 年每6 个月随访1 次，记录患者总生存率和中位生存期。

1.4 统计学方法使用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用（）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Spearman 秩和检验分析，生存分析用Kaplan-Meier 法，生存率比较用Log-rank 检验，以（%）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在结直肠癌和癌旁组织免疫组化染色情况比较MMP-2 阳性表达于癌细胞质，呈棕黄色颗粒，MMP-2 在癌组织中的阳性表达率为72.38%（152/210）显著高于癌旁组织的19.52%（41/210），差异有统计学意义（P＜0.05）；ADAM17 阳性表达于癌细胞质，呈棕黄色颗粒，在癌旁组织中无表达或仅有少量表达，210 例癌旁组织中仅有11 例（阳性率为5.24%）呈弱阳性表达，其余均为阴性，在癌组织中，ADAM17阳性表达率为78.10%（164/210），差异有统计学意义（P＜0.05）；E-cadherin 阳性表达于细胞膜内，在癌组织中的阳性表达率为41.90%（88/210）显著低于癌旁组织的96.67%（203/210），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在结直肠癌和癌旁组织免疫组化染色情况比较（SP 染色，×400）Fig.1 Comparison of immunohistochemical staining of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin in colorectal cancer tissues and adjacent tissues

2.2 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在结直肠癌和癌旁组织中的蛋白表达水平比较Western Blot结果显示，癌组织中的MMP-2、ADAM17 蛋白表达水平显著高于癌旁组织，E-cadherin蛋白表达水平显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 阳性表达与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、肝转移有关（P＜0.05），与患者性别分布、年龄、肿瘤大小、发生部位无关（P＞0.05）。见表1。

图2 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在结直肠癌和癌旁组织中的蛋白表达水平比较Fig.2 Comparison of protein expression levels of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin in colorectal cancer tissues and adjacent tissues

表1 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between expressions of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin in colorectal cancer tissues and clinicopathological characteristics例（%）

2.4 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 表达与结直肠癌患者生存情况关系210 例结直肠癌患者中位生存期24 个月（95%CI：22.57 ～25.94），5 年生存率57.04%，MMP-2 阳性组中位生存期22 个月（95%CI：20.87 ～23.58），5年生存率53.42%，MMP-2阴性组中位生存期31个月（95%CI：28.95 ～33.45），5 年生存率69.18%，两组生存情况比较，差异有统计学意义（Log-rank χ2= 4.98，P＜0.05）；ADAM17阳性组中位生存期21个月（95%CI：19.93 ～22.86），5 年生存率50.77%，ADAM17 阴性组中位生存期33个月（95%CI：30.48 ～36.40），5年生存率65.52%，两组生存情况比较，差异有统计学意义（Log-rank χ2= 7.28，P＜0.05）；E-cadherin 阳性组中位生存期30个月（95%CI：27.88 ～31.32），5年生存率47.92%，E-cadherin阴性组中位生存期16个月（95%CI：14.60～17.89），5 年生存率26.09%，两组生存情况比较，差异有统计学意义（Log-rank χ2=44.23，P＜0.05）。

图3 MMP-2、ADAM17、E-cadherin 表达与结直肠癌患者生存情况关系Fig.3 Relationship between expressions of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin and survival of patients with colorectal cancer

2.5 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在结直肠癌中表达的Spearman 相关性分析Spearman 相关性分析结果显示，MMP-2 表达与ADAM17 表达呈正相关（r=0.494，P＜0.05），MMP-2表达与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.368，P＜0.05），ADAM17 表达与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.608，P＜0.05）。

3 讨论

恶性肿瘤的浸润、转移依赖于细胞外基质的降解，MMPs 作为一类重要的水解酶，几乎能够降解所有的细胞外基质以及血管基底膜，促进肿瘤浸润、转移［10］。MMP-2 是MMPs 中的IV 型胶原酶，可降解Ⅳ、Ⅴ型胶原、层粘连蛋白等成分，破坏基膜的完整性，其活性以及表达的增加与人类多种恶性肿瘤侵袭、转移以及预后紧密相关，是恶性肿瘤进展的标志物之一［11］。GAO 等［12］发现MMP-2 在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，其表达与肿瘤分化、侵袭深度、淋巴结转移以及肿瘤分期有关。PENG 等［13］应用免疫组化研究发现MMP-2 在结直肠癌中表达与肿瘤浸润、分期、淋巴结转移以及生存率有关，且主要表达于肿瘤细胞的侵袭区域。本研究结果显示，MMP-2 在结直肠癌组织中的阳性表达显著高于癌旁组织，MMP-2表达与结直肠癌TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、肝转移有关，与患者性别、年龄、肿瘤大小、发生部位无相关性，且TNM 分期越晚，发生淋巴结转移与肝转移的危险性越大，以及分化程度越低患者表达越高，表明MMP-2 表达与结直肠癌侵袭、转移密切相关，与以往研究结果具有一致性。Kaplan-Meier 生存分析显示，MMP-2 阳性组生存率显著低于阴性组，表明MMP-2阳性表达预示患者预后不佳，可能作为结直肠癌预后判断的指标之一。

ADAM17 是一种具有蛋白剪切酶样作用的与细胞膜结合的糖蛋白，可水解释放多种表皮生长因子受体配体，表皮生长因子膜外部分与配体结合，激活表皮生长因子络氨酸激酶活性并参与细胞内信号转导途径，调控肿瘤发生、发展与转移［14］。PENG 等［15］研究发现，ADAM17 可调节结直肠癌细胞生长，对化疗敏感性造成影响。教瑞等［16］证实，发生肿瘤细胞转移的组织ADAM17 阳性表达率显著高于未发生转移的组织，其阳性表达与结直肠癌患者肿瘤浸润深度、TNM 分期以及是否发生淋巴转移显著相关。本研究结果显示，ADAM17 在结直肠癌组织中的阳性表达显著高于相应的癌旁组织，ADAM17 表达与结直肠癌TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、肝转移有关，与患者性别分布、年龄、肿瘤大小、发生部位无相关性，且TNM 分期越晚，发生淋巴结转移与肝转移以及分化程度越低患者表达越高，表明ADAM17 可能在结直肠癌进展过程中发挥作用，与以往报道相符。Kaplan-Meier 生存分析显示，ADAM17 阳达组生存率显著低于阴性组，表明。

文献研究数据表明，E-cadherin 在多种肿瘤组织中的表达较正常组织有不同程度下降，E-cadherin 表达降低导致肿瘤细胞间的黏附能力下降，进而与原发部位脱离，促进肿瘤浸润、转移［17］。本研究结果显示，E-cadherin 在结直肠癌组织中的阳性表达显著低于癌旁组织，E-cadherin 表达与结直肠癌TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、肝转移有关，与患者性别分布、年龄、肿瘤大小、发生部位无相关性，且TNM 分期越早，未发生淋巴结转移与肝转移以及分化程度越高患者表达越高。进一步使用Kaplan-Meier 生存分析显示，阳性表达组生存率显著低于阴性表达组，与教瑞等［16］研究结果一致。上述研究结果表明，E-cadherin 可能与结直肠癌侵袭、转移密切相关，其阳性表达的结直肠癌患者预后不良，检测其表达水平有望成为判断结直肠癌患者病情的重要指标。

本研究结果还显示，结直肠癌组织中MMP-2表达与ADAM17 表达呈正相关，E-cadherin 表达与MMP-2、ADAM17 表达呈负相关，表明以上三种蛋白联系紧密，在结直肠癌发生、发展过程中起重要作用。YE 等［17］表明，ADAM17 通过脱落EGFR配体TGF-α，激活EGFR-MEK-ERK 信号转导途径，导致MMP-2、MM-9 过表达；ADAM17 还可介导多种细胞因子、生长因子以及黏附分子（如Ecadherin、N-cadherin）等的脱落，促进肿瘤转移、浸润［18］。研究显示，MMPs 可裂解E-cadherin 细胞外结构，促使其成为可溶性E-cadherin，MMPs 还与细胞膜表面结构E-cadherin 代谢有关［19］。因此，MMP-2、ADAM17 上调表达，E-cadherin 下调表达，可能参与结直肠癌的进展过程，但具体的分子机制还需进一步研究。本研究为MMP-2、ADAM17及E-cadherin 成为对结直肠癌治疗的靶点药物提供了一定的理论基础，为积极寻找其上下游因子提供了根据，从而有利于结直肠癌治疗提供更多选择，以造福更多的患者。但本次研究样本量有限，且为单中心研究，对于MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 参与调控结直肠癌的信号通路有待深入阐明。后续可以纳入更多样本量以及开展多中心研究，还可以补充动物或者细胞实验以进一步为本次研究提供支持。

综上所述，MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 对结直肠癌的发生、发展具有重要的意义，其表达水平与患者预后密切相关，研究三者的相关性将有助于加深对结直肠癌侵袭、转移分子机制的理解，对于结直肠癌治疗以及预后评估有一定的价值。