circ_NEK6靶向miR-370-3p对分化型甲状腺癌131I耐受细胞恶性生物学行为的影响

陈富坤 邓智勇 刘超 吕娟 贾莉 杨传周 刘鹏杰 冯志平

1云南省肿瘤医院核医学科（昆明650118）；2昆明医科大学第三附属医院核医学科（昆明650118）

分化型甲状腺癌（DTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤，虽然仅占全身恶性肿瘤的2.6%，但近年来发病率迅速增长［1］。放射性核素131I 是治疗DTC 的有效方法［2］。然而，由于DTC 细胞对131I 发生继发性放疗抵抗，导致放疗后病灶残留、增殖和转移，无法达到预期治疗效果。研究［3］发现，环状RNA（circRNA）的异常表达与肿瘤的放疗抵抗密切相关。例如，circ_CCDC66［4］和circ_MTDH.4［5］参与调控肿瘤放疗抵抗。前期研究［6］证实，circ_NEK6 在甲状腺癌组织和细胞系中异常高表达，但其在DTC 细胞131I 耐受的作用机制尚不清楚。此外，在线生物学数据库显示，miR-370-3p 作为circ_NEK6的潜在靶基因之一，且miR-370-3p 在多种恶性肿瘤发展进程中作为抑癌基因，包括甲状腺癌［6］、宫颈癌［7］和白血病［8］，同时，miR-370-3p 也参与调控恶性肿瘤细胞的放疗耐受性［9］。然而，circ_NEK6通过靶向miR-370-3p 调控DTC 的131I 放疗抵抗分子机制尚不清楚。因此，本研究拟探讨circ_NEK6对131I 耐受DTC 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响以及其潜在作用机制，以期为临床治疗131I 放疗抵抗的DTC 患者提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本收集2016 年5 月至2019 年5 月于云南省肿瘤医院核医学科救治的DTC 患者经手术切除的组织标本。纳入标准：（1）病理证实为DTC；（2）行甲状腺全切或次全切除；（3）首次接受131I 治疗；（4）预期生存期不低于1 年。排除标准：（1）治疗前血常规异常者；（2）接受过其他免疫治疗或者放化疗者；（3）心脏、肝、肾等重要脏器功能出现严重不全者。此外，根据中华医学会核医学会公布的131I 治疗DTC 指南（2014 版）［10］，将患者分为131I 敏感组（20 例）和131I 耐受组（20 例）。其中131I耐受组评判标准［11］：（1）转移灶在清甲成功后首次131I 治疗后全身显像中即表现为不摄碘；（2）原本摄碘的功能性转移灶经131I治疗后逐渐丧失摄碘能力；（3）部分转移灶摄碘，而部分转移灶不摄碘，且可被18F-FDG PET/CT、CT 或MRI 等其他影像学检查所显示；（4）摄碘转移灶在经多次131I 治疗后虽然保持摄碘能力，但仍在1年内出现病情进展的患者。131I敏感组评判标准［11］：甲状腺癌术后经131I治疗后残留甲状腺组织清甲完全。所有组织标本取出后立即储存于-80 ℃冰箱保存备用。手术前均告知患者并签署知情同意书，并获得本医院伦理委员会批准。

1.1.2 细胞系和主要试剂人DTC 细胞、人甲状腺滤泡上皮细胞以及HEK-293T 均购自北纳生物；DMEM 和Trizol 试剂盒购自Thermo 公司；胎牛血清购自Gibco 公司；LipofectamineTM3000 和逆转录试剂盒购自TaKaRa 公司；CCK-8 试剂盒购自上海碧云天公司；Transwell 小室购自康宁公司；双荧光素酶报告基因购自Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及转染采用含有10%的胎牛血清和双抗的DMEM 培养上述细胞系。待Res-BCPAP 细胞生长密度达到80%时，将细胞调整密度2 × 105个/孔平铺到6 孔板中，严格参照LipofectamineTM3000 试剂说明书进行转染处理，分为敲降circ_NEK6 组、敲降miR-370-3p 组、同时敲降circ_NEK6+miR-370-3p inhibitor 组，转染培养6 h后，更换正常DMEM 继续培养用于后续实验。

1.2.2131I 耐受细胞构建参考前期文献［12］，将对数生长期的BCPAP 细胞置于0.5 mCi 放射性核素131I 照射下培养24 h。更换新鲜的DMEM 继续培养，并观察细胞活力，若无明显死亡则选择该对数期细胞增加剂量，反复传代培养，直至最后在131I（1.05 mCi）照射下能够稳定存活，即构建成功131I放疗抵抗细胞株Res-BCPAP。

1.2.3 RT-qPCR收集组织和细胞，采用Trizol提取总RNA，并采用NanoDrop 检测RNA的浓度。随后，采用一步法逆转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，严格按照qPCR 试剂盒说明书检测circ_NEK6 和miR-370-3p 的表达，以U6 和GAPDH 为内参。

1.2.4 细胞增殖检测将处理的Res-BCPAP 细胞培养至对数生长期，以每孔1 × 105个细胞接种96孔板，每组设置6 个复孔，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养0、24、48 和72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液（0.5 mg/mL）后继续于培养箱中孵育4 h 后，采用酶标仪检测450 nm 处的每孔光密度（OD450）值。

1.2.5 细胞凋亡检测将经转染后的细胞调整浓度为1 × 105个/孔接种到6 孔板，过夜培养后用胰蛋白酶消化细胞，PBS 洗涤后加入300 μL 结合液重悬，加入10 μL Annexin V-FITC 室温避光孵育15 min，再加入5 μL PI 溶液染色，混合均匀后避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。

1.2.6 细胞侵袭和迁移检测将经转染处理的细胞，以1 × 105个/孔的浓度接种于Transwell 小室上室，下室加入500 μL DMEM后常规培养24 h。培养结束后采用1%结晶紫染色20 min，并于光学显微镜下随机选择5 个视野计算侵袭和迁移细胞数。对于侵袭实验，Transwell 小室上室需采用Matrigel胶包被，其他实验与迁移实验步骤一致。

1.2.7 双荧光素酶报告实验由湖南普拉特泽生物科技有限公司构建circ_NEK6 基因的3′UTR，插入pGL3-Promoter 质粒载体中，将该重组质粒命名为pGL3-circ_NEK6-3′UTR WT，采用基因突变法定点突变获得circ_NEK6 突变型载体（pGL3-circ_NEK6-3′UTR MUT）。然后，将HEK-293T 细胞接种于12 孔板中，待细胞汇合度达到70%时分别将miR-370-3p mimic、miR-NC、circ_NEK6 野生型载体、circ_NEK6 突变型载体共转染于细胞中，转染6 h 后更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM 培养液，继续培养36 h。最后，采用双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 对所有数据进行统计学分析，并利用GraphPad Prism 8 对实验数据进行绘图。其中两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_NEK6在DTC组织和细胞系中高表达RT-qPCR结果显示，circ_NEK6 在131I 耐受DTC 组织中的表达明显高于敏感组织（P＜0.001，图1A）。相比于Nthy-ori3-1 细胞，circ_NEK6 在DTC 细胞系中高表达（P＜0.001，图1B），特别是在BCPAP细胞。此外，circ_NEK6 在Res-BCPAP 细胞中的表达高于其亲本细胞BCPAP（P＜0.01，图1C）。由此可知，circ_NEK6 的高表达可能与DTC 的131I 耐受相关。

2.2 敲降circ_NEK6 可显著抑制Res-BCPAP 细胞增殖和诱导细胞凋亡相比于对照组，敲降circ_NEK6 可下调Res-BCPAP 细胞中circ_NEK6 的表达（P＜0.001，图2A）。同时，敲降circ_NEK6 组细胞增殖受到抑制（图2B），凋亡百分数上调（P＜0.001，图2C、D）。

图1 circ_NEK6 在DTC 组织和细胞系中的表达水平Fig.1 The expression of circ_NEK6 in DTC tissues and cell lines

图2 敲降circ_NEK6 对Res-BCPAP 细胞增殖和凋亡的影响Fig.2 Effect of circ_NEK6 knockdown on Res-BCPAP cell proliferation and apoptosis

2.3 敲降circ_NEK6可显著抑制Res-BCPAP细胞侵袭和迁移能力Transwell 检测结果显示，相比于对照组，敲降circ_NEK6 组Res-BCPAP 细胞侵袭（图3A）和迁移能力（图3B）显著下调（均P＜0.001）。

图3 敲降circ_NEK6 对Res-BCPAP 细胞侵袭和迁移能力的影响Fig.3 Effect of circ_NEK6 knockdown on Res-BCPAP cell invasion and migration abilities

2.4 circ_NEK6 靶向下调miR-370-3p 的表达Starbase 数据库预测显示，miR-370-3p 与circ_NEK6存在结合位点（图4A）。同时，miR-370-3p 在Res-BCPAP 细胞中的表达水平明显低于其亲本细胞（P＜0.001，图4B）。双荧光素酶报告基因结果显示，过表达miR-370-3p 显著下调野生型circ_NEK6载体的荧光素酶活性（P＜0.01，图4C），但对突变型circ_NEK6 载体没有影响。此外，miR-370-3p 在敲降circ_NEK6组中的表达高于si-NC组（P＜0.01，图4D）。由此可知，circ_NEK6靶向负调控miR-370-3p 的表达。

2.5 敲降circ_NEK6 靶向上调miR-370-3p 抑制Res-BCPAP细胞恶性生物学行为相比于对照组，miR-370-3p在miR-370-3p inhibitor组中的表达下调（P＜0.001，图5A），但回复组（miR-370-3p inhibitor和si-NEK6）上调miR-370-3p的表达（P＜0.001）。相比于敲降circ_NEK6 组，细胞增殖活力（图5B）明显上调，细胞凋亡水平下调明显（P＜0.001，图5C、D）。Transwell检测结果显示，相比于敲降circ_NEK6 组，回复组细胞侵袭（P＜0.001，图5E、G）和迁移（P＜0.001，图5F、H）能力明显上调。由此可知，敲降circ_NEK6 通过靶向上调miR-370-3p 的表达水平，进而抑制Res-BCPAP 细胞增殖、侵袭和迁移能力，以及诱导细胞凋亡。

图4 miR-370-3p 是circ_NEK6 的靶基因Fig.4 miR-370-3p was a target gene of circ_NEK6

图5 circ_NEK6 靶向miR-370-3p 对Res-BCPAP 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响Fig.5 Effect of circ_NEK6 on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration capacities of Res-BCPAP cells via targeting miR-370-3p

3 讨论

大量文献［13-15］证实非编码RNA（包括miRNA、lncRNA 和circRNA）通过调控肿瘤细胞恶性生物行为介导多种恶性肿瘤放疗抵抗。尤其是circRNA可作为恶性肿瘤放疗抵抗的重要调控因子［16］。例如，经放疗处理的宫颈癌细胞中有153 个差异circRNA异常表达（其中76个上调和77个下调）［17］。GUAN 等［18］证实，敲降circ_PITX1 通过靶向抑制miR-329-3p 促进胶质瘤细胞对放疗的敏感性。LIU 等［19］研究表明，敲降circ_100367 通过抑制放疗抵抗KYSE-150R 细胞增殖、侵袭和迁移，从而缓解食管鳞状细胞癌细胞对放疗的抵抗。本研究同样证实，circ_NEK6 在131I 耐受DTC 组织和细胞系中异常高表达，敲降circ_NEK6 通过靶向上调miR-370-3p 显著抑制了131I 耐受细胞增殖、侵袭和迁移能力。同时，LIU 等［20］也证实，lncRNA MEG3 通过靶向miR-182 增强甲状腺癌细胞对131I 的敏感性。

大量研究证实，circRNA 通过靶向结合下游miRNA 参与调控恶性肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。例如，circ_AGFG1 通过靶向抑制miR-370-3p 促进宫颈癌细胞增殖和迁移能力［7］。circ_MYO10 通过抑制miR-370-3p 促进骨肉瘤细胞增殖和上皮间质转化，进而加速肿瘤的恶化进程［21］。miR-370-3p作为抑癌基因，在多种恶性肿瘤组织和细胞系中低表达［22］。过表达miR-370-3p 可明显抑制肿瘤细胞恶性生物学行为［23］，进而增强肿瘤细胞对放疗敏感性［9］。然而，目前尚未有研究证实miR-370-3p在DTC 细胞对131I 耐受过程中的作用机制。本研究结果显示，miR-370-3p 在131I 耐受Res-BCPAP 细胞中的表达低于BCPAP 细胞，且敲降miR-370-3p 可缓解circ_NEK6 敲降对Res-BCPAP 细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。也有研究表明，过表达miR-370-3p 增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［24］。以上研究提示，miR-370-3p 可能是增强DTC 对131I 放射敏感性的有效性靶点。

综上所述，本研究证实circ_NEK6/miR-370-3p分子轴与DTC 细胞对131I 耐受有关，敲降circ_NEK6通过靶向上调miR-370-3p 显著抑制Res-BCPAP 细胞增殖、侵袭和迁移能力。本研究为临床上治疗DTC 患者对131I 放射性粒子植入治疗产生抵抗提供有效的治疗靶点。