一测多评法测定板蓝根中6种化学成分的含量

黄 远，董福越，李楚源，王德勤

广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东 广州 510515

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis in digoticaFortune 的干燥根，主要含有木脂素类、生物碱类、核苷类等活性成分，具有清热解毒、凉血利咽的功效[1]。现代药理学研究表明，木脂素（lignan）具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和保肝等多种药理活性和重要的应用价值[2-9]。核苷（nucleoside）是中成药抗病毒的活性成分[10-13]，在板蓝根药材中含量较高且易溶于水，对板蓝根及其制剂的疗效和质量影响较大；板蓝根的生物碱类（alkaloids）成分能够抗炎、抗病毒、解热[14]。然而，现行《中国药典》板蓝根的含量测定项下仅采用HPLC 测定水提液中的(R,S)-告依春的含量作为质量控制指标，对板蓝根尚未建立完善的质量控制方法[15-16]。因此，多成分、多指标的控制方法对评价功效多样、成分复杂的板蓝根的质量研究有重要意义[17-21]。本研究采用一测多评（QAMS）技术，选取价廉易得的生物碱类化合物(R,S)-告依春作为参照物，建立其与木脂素类化合物直铁线莲宁B 以及核苷类化合物胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子，实现通过只测定板蓝根的(R,S)-告依春的含量，用校正因子计算出另外5 种木脂素类和核苷类成分的含量，从而简便快捷、全面准确地对板蓝根进行多指标的质量评价，有助于保证该产品的质量可控和疗效稳定，同时节约检测成本和时间。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；UltiMate 3000 系列高效液相色谱仪（美国Thermo Scientific Technologies 公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；色谱柱Agilent ZORBAX-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；色谱柱Waters Xbridge-C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；色谱柱Phenomenex Kinetex-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；BT 214D 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；CP225D 型电子分析天平（Sartorius AG 公司）

图2 混合对照品 (A) 与板蓝根样品 (B) 的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed references (A) and sample (B)

1.2 试药

对照品(R,S)-告依春（批号111753-201706，质量分数为99.9%）、尿苷（批号110887-201803，质量分数为99.5%）、鸟苷（批号111977-201501，质量分数为93.6%）、腺苷（批号110879-201703，质量分数为99.7%）均由中国食品药品检定研究院提供，胞苷（批号B20073，质量分数为98%）由源叶生物有限公司提供，直铁线莲宁B（批号hysC201811，质量分数为99%）由广州呼研所制药有限公司提供。甲醇（色谱纯，美国Tedia 公司），甲醇（分析纯，广州化学试剂厂），水为超纯水。

板蓝根（批号1807003、1805015、1808008、1805011、1805012、1805013、18wdct、18bjz、18nm、18dtly、18mLsb、18gjwzc、1805010、1806004、18nxgy、2017dq、1805014、18dtxh、18mLxt、18esyc、18dsc、18ftkfq、18gfc）由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm)；流动相为水（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～3 min，3% B；3～20 min，3%～8%B；20～25 min，8%～22% B；25～35 min，22%B；35～36 min，22%～25% B；36～48 min，25%B；48～50 min，25%～90% B；50～60 min，90%B；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254、230 nm；进样体积10 µL。色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取 (R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含(R,S)-告依春质量浓度为 28.96、57.92、115.8、289.60、579.20 μg/mL，直铁线莲宁 B 质量浓度为 3.2、6.4、12.7、25.4、63.6 μg/mL、胞苷质量浓度为2.2、4.3、8.6、17.3、43.2 μg/mL，尿苷质量浓度为3.8、7.7、15.4、30.7、76.8 μg/mL，鸟苷质量浓度为3.8、7.8、15.5、31.0、77.6 μg/mL 和腺苷质量浓度为2.8、5.6、11.2、22.4、56.0 μg/mL的混合对照品溶液，并于 4 ℃冰箱中避光保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取板蓝根药材1 g（过60 目筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声提取（40～50 ℃，250 W，80 kHz）1 h，放冷，称定质量，用5%甲醇补足超声过程减失的质量，滤过，取续滤液，过0.22 µm 微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取6 个系列浓度的混合对照品溶液，各 10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测定各对照品的峰面积，取平均值。以各溶液质量浓度（X）对峰面积积分值（Y）进行回归处理，得(R,S)-告依春、直铁线莲宁 B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的线性方程和相关系数（R2）。结果表明，各对照品的进样量与峰面积均呈良好的线性关系（表1）。

表1 6 种成分的线性回归方程Table 1 Linear regression equations of six components

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10 µL，按“2.1”项下条件，连续进样6 次。结果显示在230 nm 下，(R,S)-告依春、直铁线莲宁B 的RSD 分别为0.33%、0.58%；在254 nm下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的RSD分别为0.35%、0.58%、0.45%、0.41%、0.45%。

2.4.3 重复性试验 取批号为1808008 的板蓝根药材，按照“2.3”项平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下条件，进行测定，在254 nm 下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的RSD 分别为0.81%、1.56%、1.96%、1.65%、3.15%；在230 nm下(R,S)-告依春、直铁线莲宁B 的RSD 分别为1.04%，1.79%。

2.4.4 稳定性试验 取批号为1808008 的板蓝根药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，于0、8、12、16、20、24 h，按“2.1”项下条件进样测定，在254 nm 下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的RSD 分别为0.85%、1.88%、1.36%、0.87%、6.84%；在230 nm 下，(R,S)-告依春、直铁线莲宁B 的RSD 分别为0.5%、1.72%。腺苷的峰面积在不同时间段波动较大，说明板蓝根供试品溶液中(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷在室温放置24 h 内稳定性良好，但是腺苷不稳定。

2.4.5 加样回收试验 取已测定的样品（批号1808008）9 份，精密称定，分别精密加入相当于供试品中待测成分含量的50%、100%、150%的混合对照品溶液，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得到(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷和鸟苷的平均加样回收率分别为 98.25%、99.57%、100.53%、102.29%、102.59%、99.30%，RSD 分别为 2.25%、2.45%、3.35%、1.62%、2.96%、2.79%。结果见2。

2.5 相对校正因子（fk/m）的建立

精密吸取混合对照品溶液5、10、15、20、30 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，每个浓度分别进样3 次，取平均值，记录各对照品的色谱峰面积，根据fk/m计算公式[2-3]。计算待评价成分直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子（表2）。

fk/m＝fk/fm＝(Wk×Am)/(Wm×Ak)

Wk为(R,S)-告依春内标物的含量，Ak为(R,S)-告依春内标物的峰面积，Wm为被测指标组分m的含量，Am为被测成分m的峰面积

2.6 fk/m 的耐用性评价

2.6.1 不同色谱柱对fk/m的影响 取“2.2”项下的混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，采用Agilent C18色谱柱，分别在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996 高效液相色谱仪上进样检测，求算以(R,S)-告依春作为参照成分时，5 种成分的fk/m，结果说明fk/m在使用不同仪器时的耐用性良好，结果见表3。

考察了Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Kinetex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）共3 种色谱柱对各成分fk/m的影响。使用以上色谱柱各成分均能达到较好的分离效果，结果胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、直铁线莲宁 B 的 RSD 依次为 2.69%、3.41%、3.15%、3.09%、2.60%。表明色谱柱的更换对各成分fk/m无显著影响（表3）。

表2 5 种成分的fk/mTable 2 Relative correction factors (fk/m) of five components

表3 不同色谱柱对fk/m 的影响Table 3 fk/m of different columns

2.6.2 不同流动相体积流量对fk/m的影响 考察了不同体积流量（1.0、1.1、1.2 mL/min）对各成分fk/m的影响。结果表明（表4），各成分的RSD 依次为1.30%、0.33%、0.79%、1.00%、2.16%。表明体积流量的波动对各成分fk/m无明显影响。

2.6.3 不同仪器对fk/m的影响 考察了不同仪器（安捷伦1260、戴安U-3000、沃特世2695）对各成分fk/m的影响，结果（表5）各成分的RSD%依次为2.91%、3.11%、3.32%、4.16%、3.09%。表明仪器的更换对各成分fk/m无显著影响。

表4 不同体积流量对fk/m 的影响Table 4 fk/m factor of different flow rates

表5 不同仪器对fk/m 的影响Table 5 fk/m of different instruments

2.7 色谱峰定位参数考察

为了在仅采用(R,S)-告依春为对照品时，能够确认直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷色谱峰的位置，从而通过获得的相对校正因子同时计算另外5 种成分的含量，达到一测多评的目的，考察了采用不同仪器、不同色谱柱和不同实验人员时直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和 (R,S)-告依春色谱峰之间的保留时间差和相对保留时间2 个参数。考察结果发现，另外5 种成分和参照物 (R,S)-告依春之间的保留时间差波动较大，而相对保留时间波动较小，RSD 均小于5%（表6、7）。因此，可利用相对保留时间进行定位。

表6 不同因素对保留时间差值的影响Table 6 Influence of different factors on retention time difference

表7 不同因素对相对保留时间的影响Table 7 Influence of different factors on relative retention time

2.8 QAMS 法与外标法结果比较研究

采用了HPLC法，以(R,S)-告依春作为“一测多评”的参照成分，测定其在板蓝根中的含量，并通过测得的直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的fk/m，分别计算出这5 种成分的含量。同时，使用外标法测定了板蓝根中(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的含量，将外标法测定含量与QAMS 法计算的含量采用相对偏差法进行比较，从而验证QAMS 法用于测定板蓝根中的多种类成分测定的准确性（表8）。

表8 QAMS 法与外标法测定26 批药材中6 种成分的比较Table 8 Comparison of determination of six components in 26 batches of medicinal materials by QAMS and ESM

3 讨论

3.1 测定波长的选择

本研究测定的化学成分种类较多，包括核苷类、生物碱类和木脂素类，共6 种化合物。采用DAD 全波长扫描对照品溶液，分别对(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷进行紫外波长扫描。结果显示，(R,S)-告依春和胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷在254 nm 处同时有较大吸收，(R,S)-告依春和直铁线莲宁B 在230 nm 处同时有较大的吸收，且干扰少，峰形良好，基线平稳，因此检测波长最终设定为254 nm 和230 nm。

3.2 内标物和质量控制指标的选择

现有QAMS 法测定(R,S)-告依春和核苷类成分的研究[1]，但是该方法选择腺苷作为内标物，测定了(R,S)-告依春、鸟苷、尿苷、胞苷的含量。本研究发现腺苷并不稳定，不适合作为内标物和质量控制指标成分；而其他核苷类成分和(R,S)-告依春较稳定，板蓝根中另一关键抗病毒性成分直铁线莲宁B 亦有良好的稳定性，均可作为质量控制指标成分；且(R,S)-告依春与其他5 种成分都可实现同波长下的较大吸收。因此，本研究选择(R,S)-告依春为内标物，结果显示各成分的相对校正因子稳定，重现性良好。

3.3 QAMS 法用于板蓝根质量控制的合理性

本研究的相对标准偏差表明，外标法和QAMS 法计算的含量相似性极高，表明2 种含量测定方法计算得到的含量值之间无显著性差异。此外，在不同高效液相色谱仪、不同色谱柱等条件下均有良好的重复性。板蓝根中化学成分众多，以外标法测定各成分含量需要对照品的数量多，部分对照品价格昂贵且难以获取，采用QAMS 法测定各成分含量能极大的减少对照品使用数量，节约成本，增加检测便利性。因此，QAMS 法用于板蓝根质量控制具有极高的实用性、便利性和科学性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突