基于经典人群口尝法和电子舌法的中药饮片水煎液苦度叠加规律研究

张 璞，张 耀，桂新景，施钧瀚，张慧杰，冯文豪，李媛媛，王艳丽，张 璐，姚 静，刘瑞新*，李学林*

1.河南中医药大学，河南 郑州 450008

2.河南中医药大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450000

3.国家中医药管理局 中药制剂三级实验室，河南 郑州 450000

4.河南省中药饮片临床应用现代化工程研究中心，河南 郑州 450000

5.河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450000

苦味作为一种人体的主观感受，其产生机制主要是苦味质与味觉细胞中的苦味受体蛋白结合使其活化，引发细胞内信号变化，从而引发神经细胞兴奋，之后传入大脑中的味觉神经中枢，使人类感知苦味[1]。目前，关于苦味的相关研究不在少数，如对中药苦味的物质基础研究[2-3]、苦味物质与苦味表达的化学结构研究[4]等，本课题组前期也对中药的苦味进行苦度的量化以及部分苦味单体化合物的叠加苦度规律进行研究[5]，但对于苦味中药水煎液的苦味叠加规律研究目前未见报道。

据不完全统计发现，中医门诊处方中应用汤剂约占50%[6]，经组方配伍后一个方剂中往往含有多种苦味饮片[7]，经水煎煮后味道繁杂，苦味强烈，难以下咽，严重影响了患者的服药依从性，影响疗效。研究中药饮片的苦味叠加规律，可为复合汤剂呈味规律的发展以及针对性研究中药掩味剂提供参考。因此，本实验拟通过经典人群口尝评价法（traditional human taste panel method，THTPM）以及电子舌法（electrionic tongue，E-tongue）开展二元（2 种组分）、三元（3 种组分）叠加中药饮片水煎液（decoction of Chinese materia medica，DCMM）的苦度叠加规律研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BSA224S-CW 型万分之一电子天平、CP225D型十万分之一电子天平，德国Sartorius 公司；HK250型科导台式超声清洗器，上海科导超声仪器有限公司；LCD-A200 型电子天平，福州华志科学仪器有限公司；HHS 型电热恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；AM-5250B 型磁力搅拌器，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；TS-5000Z 型电子舌，日本Insent 公司，本实验使用C00 传感器、AN0 传感器、BT0 传感器、AE1 传感器。

1.2 材料

盐酸小檗碱，批号170406，质量分数98.62%，四川省玉鑫药业有限公司；水为纯化水，自制；本实验用中药饮片均经河南中医药大学第一附属医院陈天朝主任药师鉴定均合格，符合《中国药典》2020年版规定，具体信息见表1。

2 方法

2.1 苦味参比液的质量浓度选择及制备

参照文献报道[8-9]，将苦味分为5 个等级，每个等级对应一定的苦度范围，以不同质量浓度的盐酸小檗碱溶液作为苦味参比液对应不同苦度等级，以THTPM 为苦度评价方法，以苦度值（Ⅰ）作为量化指标，评价单味饮片待测样品、二元叠加待测样品、三元叠加待测样品的苦度，中药Ⅰ值定性定量范围具体见表2。

表1 9 种中药饮片信息Table 1 Information of nine kinds of Chinese medicines

表2 中药苦度值 (Ⅰ) 的定性描述、等级及定量范围Table 2 Qualitative description,grade and quantitative range of bitterness value (Ⅰ) of Chinese medicines

2.2 单味饮片待测样品的制备及质量浓度选择

2.2.1 单味饮片待测样品制备 根据韦伯-费希纳定律及本课题组前期研究成果[10]，并参考《中国药典》2015年版[11]规定用量，称取不同量中药饮片制备单味待测样品，将饮片置于适宜容器内；加水600 mL，浸泡30 min，于电磁炉上加热，功率2100 W；待沸腾后，功率改为800 W，煎煮30 min，滤过；二煎加水400 mL，煎煮20 min，余同一煎，合并滤液，混匀，冷却至室温，4000 r/min 离心15 min，取上清液至1 L 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灌装，压盖，灭菌（105 ℃流通蒸汽灭菌45 min），备用。

2.2.2 待测样品质量浓度选择 根据《中国药典》2015年版中饮片的推荐用量范围进行预实验，并结合韦伯-费希纳定律，设定样品的质量浓度（以生药量计）梯度，具体如表3 所示。

表3 DCMM 待测样品所选质量浓度Table 3 Selected concentrations of samples to be tested

2.3 苦味叠加的均匀设计及样品制备

以均匀设计法作为二元、三元叠加的实验设计，以2 种、3 种饮片的共煎液作为二元、三元叠加的待测样品。

2.3.1 二元叠加均匀设计及样品制备 以生物碱类、萜类、糖苷类中药作为因素，以6 个质量浓度梯度为6 水平，质量浓度梯度同“2.2”项下，使用U6*(64)均匀设计表进行2 因素6 水平的实验设计。煎煮以黄连＋苦参二元叠加的待测样品制备为例，取黄连0.5 g、苦参3 g 共同煎煮得1 L 待测液，其余同“2.2”项下制备方法，具体实验设计见表4。

表4 二元叠加U6*(64) 2 因素6 水平实验设计Table 4 Binary superposition U6*(64) 2-factor 6-level design

2.3.2 三元叠加均匀设计及样品制备 以生物碱类、萜类、糖苷类作为因素，以6 个质量浓度梯度为6 水平，使用U6*(64)均匀设计表进行3 因素6 水平的实验设计。煎煮方法同“2.2”项，具体实验设计见表5。

表5 三元叠加U6*(64) 3 因素6 水平实验设计Table 5 Ternary superposition U6*(64) 3-factor 6-level design

2.4 THTPM 评价法

2.4.1 志愿者筛选 本研究经河南中医药大学第一附属医院医学伦理委员会审查批准后，对招募的志愿者进行了包括苦味敏感度等在内的筛选（伦理号：2017HL-066-03）。纳入标准：（1）因苦味感受随着年龄的升高而降低，故选择20岁左右成年人[12]；（2）无严重过敏史、遗传病史，无胆囊炎，无不良嗜好，且近期无疾病史。排除标准：（1）最近2 d曾饮酒或吸烟者；（2）心态过于紧张者；（3）口尝柠檬黄水溶液觉得有苦味的志愿者；（4）品尝溶液前3 h 进食（尤其是刺激性食物）者。本研究最终选择健康志愿者21 名（男性5 名、女性16 名）。上述志愿者均知情同意并签署了知情同意书。

2.4.2 志愿者口尝评价标准化培训 具体参照文献方法[5]，分别取20 mL，37 ℃下表2 中各质量浓度的盐酸小檗碱参比溶液于口尝杯中，由志愿者含于口中，计时15 s，在口腔进行漱口动作，目的是使舌根及舌侧苦味的感受区域能够感知样品的苦味，根据表2 的描述对比记忆参比溶液的Ⅰ分级和具体Ⅰ值，吐出后用蒸馏水漱口至少3 次，直至口腔中不再有苦味感受，15 min 后测定另一质量浓度的参比溶液，最终完成苦味的标准化感官记忆。

2.4.3 待测样品组的口尝评价 待测样品组具体的口尝操作要求同标准化培训，口尝后记录样品的Ⅰ等级及Ⅰ值。

2.5 E-tongue 评价法

2.5.1 电子舌参比液制备

（1）正极清洗液配制：准确称量7.46 g 氯化钾，500 mL 蒸馏水搅拌溶解，然后准确加入300 mL 无水乙醇，边搅拌边加入准确称量的0.56 g 氢氧化钾，溶解完毕后，转移到1000 mL 量瓶中，定容，即得。

（2）负极清洗液配制：准确量取300 mL 无水乙醇，与500 mL 蒸馏水震荡混合，然后加入8.3 mL浓盐酸搅拌混合，转移到1000 mL 量瓶中，定容，即得。

（3）参比液配制：准确称量2.24 g 氯化钾和0.045 g 酒石酸，取适量蒸馏水溶解并转移至1000 mL 量瓶中，定容，即得。

2.5.2 电子舌测试方法 首先将传感器在清洗液中清洗90 s，接着用参比液清洗120 s、继续用另一参比液清洗120 s，传感器在平衡位置归零30 s，达到平衡条件后，开始测试，样品测试时间30 s，输出先味值；后在2 组参比液中分别短暂清洗3 s，传感器插入新的参比液中测试回味30 s，循环测试4次，去掉第1 次循环，取后3 次平均数据作为测试结果。

2.5.3 电子舌传感器选择 TS-5000Z 型电子舌共有C00、AN0、BT0、AE1、GL1、CA0、CT0 7 根传感器，其中C00 和AE1 传感器有前、后2 种苦味信息，称为先味和回味，而AN0 和BT0 传感器只输出回味值。因此本实验选取跟苦味有关的4 根传感器，分别为C00、AN0、BT0、AE1 传感器，共输出6 种味觉信息值，具体如表6。

表6 传感器味觉信息Table 6 Sensor taste information

2.6 数据处理与分析

2.6.1 异常值处理 本实验由志愿者进行感官评价，由于人的主观性及个体差异，可能造成不同志愿者之间的苦味评价结果存在差异，实际测试中个别数据会偏离整体水平，但又不能作为异常值直接予以剔除，因此参照文献采用Grubbs 检验法[13]对数据进行异常值的循环检验和剔除。每组数据每轮仅剔除1 个异常值，进行多轮的循环检验剔除。此外，测试数据值过大和过小均有可能成为异常值，因此采用双侧检验进行剔除[14]，本实验选择检出水平为0.1、剔除水平为0.05。

2.6.2 模型构建 本实验在单味苦味DCMM 的研究基础上，探索不同苦味DCMM 二元、三元相互叠加规律，构建二元、三元叠加DCMM 的叠加苦度-质量浓度对数（IZ-lnC）、叠加苦度-叠加前分苦度（IZ-I）、口尝叠加苦度-电子舌叠加苦度（IZo-IZe）拟合模型。

单元构建模型：I＝f1(C)＝β[1－e-(C－α)m/k]，I＝f2(C)＝alnC＋b，其中，C表示质量浓度，a、b、α、β、m、k为待定参数。

二元、三元构建模型：IZ＝f3(lnC1,…lnCn)，IZ＝f4(I1,…In)，IZo＝f5(IZe)，其中，C表示叠加前各组分质量浓度，lnC表示叠加前各组分质量浓度的对数，Ⅰ表示叠加前各组分苦度，IZ表示叠加苦度，IZo表示口尝叠加苦度，IZe表示电子舌叠加苦度，n＝2或3。

用SPSS 22.0 软件对实验结果进行多元线性回归分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。拟合过程中如果曲线形式可表示为X的某种变换形式与Y的线性关系，即“曲线直线化”[15]，拟合度应以调整后的R2为准，故结果中R2均为调整后R2，用Rc2表示。

2.6.3 贡献率判断标准 本实验拟合方程为二次多项式或近似结构的模型，各组分对叠加后Ⅰ的贡献率判断方法如下：（1）同次项以标准化回归系数分析组分对叠加后Ⅰ的贡献率；（2）一次项与二次项同时存在，则根据变量取值范围并结合标准化回归系数综合分析。

3 结果

3.1 THTPM 结果

3.1.1 异常值剔除结果 对口尝实验的苦度测试结果进行异常值相关检验，查Grubbs 临界值Gp(n)表，对25 组（2483 个）数据进行循环检验剔除，剩余数据经过剔除后不再补充测试，以剔除后剩余的每组的平均值作为最终测试的I值。25 组样品共剔除43 个异常值。

3.1.2 单味DCMM 口尝苦度（Io）与质量浓度（C）的关系 根据韦伯-费希纳定律，以单味饮片质量浓度C作为自变量，口尝苦度Io为因变量，对9 种单味DCMM 进行Io-C拟合，其威布尔、对数方程的拟合结果如表7 所示。其中，威布尔方程整体上优于对数方程，因此采用威布尔模型作为一元口尝苦度的拟合模型。整体而言，3 种类型的单味DCMM的口尝苦度均随质量浓度的增加而增加。

表7 单味DCMM 质量浓度 (C) 与口尝苦度 (Io) 的拟合模型结果 (n = 6)Table 7 Fitting model results of concentration (C) and bitterness (Io) of single-flavor DCMM (n = 6)

图1 二元叠加口尝苦度 (IZo) 与 质量浓度 (C) 的三维图Fig.1 Three-dimensional graph of binary superposition of bitterness (IZo) and concentration (C)

3.1.3 口尝叠加苦度的均匀设计回归分析

（1）二元叠加实验：对“2.3.1”项下6 组二元叠加实验样品进行口尝测定，其中3 组为同类型叠加，以每组中各饮片水煎液质量浓度C、叠加后口尝苦度IZo进行绘图，结果见图1。

采用多元线性回归法拟合叠加苦度IZo与lnC的最佳回归方程，结果如表8 所示。其中，拟合度Rc2≥0.875，P＜0.01，拟合方程类型为二次多项式或其近似结构。根据单味DCMM 质量浓度可以很好地拟合出叠加DCMM 口尝苦度的预测方程。

表8 二元叠加DCMM 口尝苦度 (IZo) 与单味DCMM 质量浓度的对数 (lnC) 的最佳拟合方程 (n = 6)Table 8 Best-fitting equation of binary superposition DCMM bitterness (IZo) and concentration logarithm (lnC) of single-flavor DCMM (n = 6)

根据二元叠加DCMM 口尝结果，拟合二元叠加DCMM 口尝苦度IZo与单味DCMM 口尝苦度Io关系的最佳回归方程（表9）。其中，5 组方程P＜0.01，Rc2≥0.868，结果表明，根据单味DCMM 的口尝苦度可以很好地拟合出叠加DCMM 的口尝苦度预测方程。

（2）三元叠加实验：根据10 组三元叠加DCMM的口尝结果，采用多元线性回归法拟合叠加DCMM苦度IZo与lnC的最佳回归方程（表10），共9 组，其中6 组P＜0.01，Rc2≥0.871，但黄芩＋连翘＋野菊花未拟合出有意义的最佳方程。

根据三元叠加DCMM 口尝结果，拟合三元叠加DCMM 口尝苦度IZo与单味DCMM 口尝苦度Io关系最佳回归方程（表11）。共得到9 组有效方程，Rc2≥0.659，P＜0.05，但黄芩＋连翘＋野菊花组未得到有显著性意义的拟合方程。

在二元、三元叠加中，IZ-lnC、IZ-I共得到30组有意义的拟合方程，P＜0.05，其中23 组拟合方程P＜0.01，Rc2≥0.855，即单味DCMM 的质量浓度与口尝苦度可以很好地拟合出叠加DCMM 口尝苦度的预测方程。

综合标准化回归方程的系数以及在一定范围内各组分饮片质量浓度或苦度对叠加后苦度影响程度分析发现，三元叠加中苦参＋黄柏＋苦楝皮组由于各组分取值范围部分重叠，且IZ-lnC、IZ-I拟合方程中一次项与二次项同时存在，在变量取值范围内分析各组分变化率发现，IZ-lnC中当黄柏质量浓度C黄柏＞15.34 g/L 时黄柏贡献率较大，反之则苦参贡献度大，IZ-I中当黄柏苦度I黄柏＜2.6 时苦参影响较大、I黄柏＞2.6 时黄柏影响较大；各组别中组分1 对IZ的贡献度最大，其中14 组最佳拟合方程只与一个组分相关，且组别中出现黄连时黄连对叠加后苦度的贡献率往往大于其余组分；多类型叠加中黄连、穿心莲、龙胆的苦味贡献度均高于同组其他饮片。

表9 二元叠加DCMM 口尝苦度 (IZo) 与单味DCMM 苦度 (Io) 的最佳拟合方程 (n = 6)Table 9 Best-fitting equation of binary superposition DCMM bitterness (IZo) and single-flavor DCMM bitterness (Io) (n = 6)

表10 三元叠加口尝苦度 (IZo) 与质量浓度的对数 (lnC) 的最佳拟合方程 (n = 6)Table 10 Best fitting equation of ternary superposition bitterness (IZo) and concentration logarithm (lnC) (n = 6)

表11 三元叠加DCMM 口尝苦度 (IZo) 与单味DCMM 苦度 (Io) 的最佳拟合方程 (n = 6)Table 11 Best fitting equation of ternary superposition DCMM tongue bitterness (IZo) and single-flavor DCMM bitterness (Io)(n = 6)

3.2 电子舌法结果

以质量浓度对数为自变量，以6 根传感器的响应值为因变量，收集25 组电子舌苦度，根据实验结果，全部样品的B-bitterness2 味觉信息响应值都很高并且能区分出不同质量浓度，其次是涩味味觉信息值和苦味味觉信息值。龙胆的味觉信息响应值在所有饮片中最低。黄连和黄柏的H-bitterness 味觉信息响应值较大，但是对其余6 味药的响应及质量浓度区分都较小，因此着重分析 25 组样品的B-bitterness2、涩味和苦味味觉信息值。因篇幅原因，此处以黄连、穿心莲和龙胆为示例，结果见图2。

图2 黄连、穿心莲、龙胆的电子舌传感器灵敏度以及苦度结果Fig.2 Sensitivity and bitterness results of electronic tongue sensors of CR,AH and GRR

3.2.1 单味DCMM 电子舌苦度Ie与质量浓度C关系 采用规划求解建立威布尔和对数的单味DCMM质量浓度和电子舌苦度的拟合模型。根据对电子舌传感器响应值的分析，本实验只针对3 种传感器结果进行拟合，共计27 组数据，最终拟合出24 组有显著性意义的方程，其中，威布尔方程拟合度明显优于对数方程，因此采用威布尔模型作为一元电子舌苦度的拟合模型。具体见表12。其中，生物碱类饮片黄连、黄柏的苦味味觉信息响应值随质量浓度增加而降低，其余各单味DCMM 的电子舌传感器味觉信息响应值均随质量浓度的增加而增加。

3.2.2 电子舌叠加苦度均匀设计回归分析结果

（1）二元叠加电子舌苦度结果：根据二元叠加DCMM 电子舌结果，拟合叠加样品电子舌苦度IZo与lnC最佳回归方程，如表13 所示。共拟合出18组方程，Rc2≥0.756，P＜0.05，其中15 组方程P＜0.01，Rc2≥0.837。

根据二元叠加DCMM 电子舌测定结果，拟合二元叠加DCMM 电子舌苦度IZe与单味DCMM 电子舌苦度Ie关系最佳回归方程，结果如表14 所示。共得到18 组最佳拟合方程，其中13 组方程拟合度Rc2≥0.864，P＜0.01，表明单味DCMM 的电子舌苦度可以拟合出二元叠加DCMM 电子舌苦度的预测方程。

表12 单味DCMM 电子舌苦度 (IZo) 与质量浓度 (C) 的拟合模型结果 (n = 6)Table 12 Fitting model results of single-flavor DCMM electronic tongue bitterness (IZo) and concentration (C) (n = 6)

表13 二元叠加DCMM 电子舌苦度 (IZo) 与质量浓度的对数 (lnC) 的拟合方程 (n = 6)Table 13 Fitting equation of binary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZo) and concentration logarithm (lnC)(n = 6)

（2）三元叠加DCMM 电子舌结果：根据三元叠加混合样品电子舌苦度测定结果，采用多元线性回归法拟合叠加DCMM 苦度IZe与lnC的最佳回归方程。如表15 所示，共计27 组有显著性差异方程（P＜0.05）。其中，14 组方程P＜0.01，Rc2≥0.853。

根据三元叠加DCMM 电子舌结果，拟合三元叠加DCMM 电子舌苦度IZe与单味DCMM 电子舌苦度Ie关系最佳回归方程。共得到25 组有显著性差异方程，其中14 组拟合方程P＜0.01，Rc2≥0.925，黄芩＋连翘＋野菊花组均未得到有显著性意义的拟合方程。结果如表16 所示。

在二元、三元叠加中，IZe-lnC、IZe-I共96 组实验结果，通过多元线性回归进行分析，共88 组得到了有效的最佳拟合方程，P＜0.05，其中56 组拟合方程P＜0.01，Rc2≥0.853，表明单味DCMM 的质量浓度与电子舌苦度可以很好地拟合出叠加DCMM 的电子舌苦度预测模型。36 组最佳拟合模型中仅与组别中某一组分相关，28 组模型与组别中所有组分均相关。

综合标准化回归方程的系数以及在一定范围内各组分饮片质量浓度或苦度对叠加后苦度影响程度分析发现，二元叠加中黄连＋苦参组IZ-lnC的涩味信息拟合方程中当C苦参＞4.3 时苦参贡献度高于黄连；穿心莲＋野菊花组的B-bitterness2 信息拟合方程中在穿心莲质量浓度范围内穿心莲贡献度较大，当野菊花质量浓度取值高于穿心莲范围时野菊花贡献度较大；在涩味信息拟合方程中当C野菊花＞15.93时野菊花贡献度高于穿心莲，反之则穿心莲影响较大；三元叠加中黄芩＋连翘＋野菊花组B-bitterness2信息拟合方程中当C野菊花＞38.28 时野菊花贡献度较高，反之则黄芩影响较大；涩味信息拟合方程中当C野菊花＞24.92 时野菊花贡献度较高，反之则黄芩影响较大；而IZe-Ie中I野菊花＞7.33 时野菊花贡献度较高，反之则黄芩影响较大；含有S1 的组别中，S1对叠加后苦度影响更大；同类型叠加中苦味贡献最大的分别是黄连、穿心莲、黄芩；不同类叠加中生物碱类的苦味贡献度较高。

表14 二元叠加DCMM 电子舌苦度 (IZe) 与单味DCMM 苦度 (Ie) 的最佳拟合方程 (n = 6)Table 14 Best fitting equation of binary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZe) and single-flavor DCMM bitterness (Ie) (n = 6)

3.3 口尝法与电子舌法苦度对比模型建立

根据样品测试结果，结合回归分析，能够得到单味饮片、二元叠加、三元叠加的口尝苦度和电子舌苦度之间的最佳拟合模型为线性模型或对数模型。以电子舌苦度Ie为自变量，以口尝苦度Io为因变量，拟合电子舌苦度Ie与口尝苦度Io关系回归方程，并构建拟合模型。

从IZo-IZe的结果（表17～19）来看，27 组单味DCMM 苦度数据得到24 个有意义的线性方程（P＜0.05），91.67%的拟合度Rc2≥0.800；18 组二元叠加DCMM 苦度数据，共8 个有意义的线性方程（P＜0.05），75%的拟合度Rc2≥0.800；30 组三元叠加DCMM 苦度数据，共13 个有意义方程，方程类型为线性或对数方程（P＜0.05），69.23%的拟合度Rc2≥0.800。

25 组样品共75 组数据，其中，S1、T3、G3、S1＋S2、T1＋G1、T3＋T2＋G3 6 组样品整体拟合效果最优，而G1＋G3、S1＋S3＋G2、G1＋G2＋G3、G1＋G2＋S3 4 组样品3 个传感器无任何有意义方程，其余样品每组至少有一个有意义的方程。单味DCMM 的口尝苦度与电子舌苦度有良好相关性，叠加DCMM 的口尝苦度与电子舌苦度相关性随着叠加元素的增多而减少。

表15 三元叠加DCMM 电子舌苦度 (IZe) 与质量浓度的对数 (lnC) 的最佳拟合方程 (n = 6)Table 15 Best fitting equation of ternary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZe) and concentration logarithm(lnC) (n = 6)

4 讨论

4.1 载体的选择

根据《中国药典》2015年版[11]中对饮片的性味描述，选择“极苦”“苦”且没有其他兼味描述的饮片，同时查阅相关文献报道，根据中药饮片中含有的特征苦味物质进行分类，生物碱类：黄连（小檗碱、表小檗碱等）[16-17]、黄柏（小檗碱、黄柏碱）[18]、苦参（苦参碱、氧化苦参碱）[19]；萜类：穿心莲（穿心莲内酯、新穿心莲内酯）[20]、野菊花（单萜类、倍半萜类化合物）[21]、苦楝皮（三萜类化合物川楝素和异川楝素）[22-23]；糖苷类：龙胆（龙胆苦苷）[24]、黄芩（黄芩苷、汉黄芩苷）[25]、连翘（连翘酯苷类）[26]。

根据《中国药典》2015年版中饮片的推荐用量范围进行预实验，设定样品的浓度梯度，如药典中苦楝皮的【用法与用量】3～6 g，外用适量。用量系指每日常用剂量，按照一付药常规煎得400 mL药液，苦楝皮最高推荐质量浓度为15 g/L。苦楝皮味苦寒，有毒，但性状味为味苦，经水煎煮后苦味较极苦类饮片弱，故根据韦伯-费希纳定律及预实验确定苦楝皮的浓度梯度为1.88、3.75、7.50、15、30、60 g/L，最高质量浓度超过了药典推荐，但是作为研究探索，且经过口尝感知到样品的苦度后，会将药液吐出并漱口，药液不进入体内，保证了人体的安全。叠加实验煎药方法基于传统中药的实际煎药方法，即多种饮片共煎，本实验也采用共煎法制备水煎液，最终制得水煎液1 L，与单味中药饮片水煎液保持一致，既与实际对应也方便后续进行二元、三元叠加拟合模型的构建。

表16 三元叠加DCMM 电子舌苦度 (IZe) 与单味DCMM 苦度 (Ie) 的拟合方程 (n = 6)Table 16 Fitting equation of ternary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZe) and single-flavor DCMM bitterness (Ie) (n = 6)

4.2 THTPM 测试结果分析讨论

THTPM 是最常用的味觉评价方法之一，本实验通过THTPM 进行二元、三元叠加实验（32 组）测试，其中30 组均得到最佳拟合方程（P＜0.05）。二元叠加均得到有意义的拟合方程，三元叠加中，黄芩＋连翘＋野菊花（IZ-lnC、IZ-I）未拟合出有意义的最佳方程。14 组叠加后苦度仅与组别中某一组分相关，10 组叠加后苦度与组别中所有组分均相关。从表8～11 中标准化回归系数分析发现，同类型叠加中黄连、穿心莲、龙胆等极苦类中药对叠加后苦度的贡献度更大；不同类型同为味极苦药物的叠加中，黄连与同类别饮片、不同类别的饮片比较中，均表现出“力压众苦、唯我最苦”的呈苦特点，这与古代对黄连作为代表性苦味中药以及众多民谚中如“哑巴吃黄连，有苦说不出”“吃过黄连苦，方知蜜糖甜”“不吃黄连、不知药苦”等选择黄连作为代表的事实相吻合。萜类与糖苷类的叠加中萜类占据主导位置。

表17 单味DCMM 苦度Io-Ie 预测模型Table 17 Single-flavor DCMM bitterness Io-Ie prediction model

表18 二元叠加DCMM 苦度IZo-IZe 预测模型Table 18 Binary superposition DCMM bitterness IZo-IZe prediction model

表19 三元叠加DCMM 苦度IZo-IZe 预测模型Table 19 Three-dimensional superposition DCMM bitterness IZo-IZe prediction model

在口尝三元叠加中，黄连＋黄柏＋黄芩组拟合方程中出现黄连黄芩交互作用并与叠加后苦度呈负相关，可以推测是由于黄连、黄柏中生物碱类成分与黄芩中黄酮苷类成分相互作用，生成沉淀析出。其余组别未发现饮片之间因成分酸碱复合或沉淀反应出现的拮抗作用或协同作用影响叠加后苦度的情况。仅黄芩＋连翘＋野菊花一组未拟合出有意义的最佳方程，考虑3 种饮片均为味苦饮片，苦味强度差异不明显，叠加后组间变异较小，难以拟合出有意义的回归方程，且本次实验浓度水平数较少，后期将增加实验浓度水平数，进一步分析规律。

4.3 电子舌传感器对中药饮片的响应规律

电子舌是采用同人舌头味觉细胞工作原理相类似的人工脂膜传感器技术，对待测样品进行识别、分析、检测，在食品的风味检测中应用居多，课题组前期基于电子舌技术在中药苦味定量化检测方面进行了深入的研究。本实验是在课题组研究基础上利用日本Insent 公司TS-5000Z 型电子舌对苦味中药水煎液的叠加苦度规律进行研究。根据实验数据分析发现B-bitterness2（苦味回味）、涩味和苦味3 组味觉信息对待测样品的响应值较高，因此后续实验主要针对以上3 组传感器的电子舌苦度值进行分析。

电子舌测定结果显示，龙胆响应值明显低于其他饮片，与药典中龙胆“极苦”以及口尝结果均不相符，但整体上苦度随浓度增加而增加。经查阅文献发现[27]，多采用龙胆粉末冷浸液进行电子舌测试，而本实验是采用龙胆水煎液作为研究对象，出现响应值低可能是龙胆经水煎煮后成分发生变化或者传感器对龙胆水煎液中的苦味物质响应不完全。大多数样品的各传感器味觉信息响应值都随浓度升高而升高，而黄连与黄柏的苦味味觉信息响应值均随浓度的升高而降低，苦参与龙胆的苦味响应值未拟合出有意义的方程，这表明随着浓度的升高，苦味响应值无显著的变化规律。而苦味DCMM的苦味味觉信息响应值测试结果较差有两种可能性，一种是浓度梯度设置不合适，不能使苦味响应值有较大变化，一种是使苦味特征响应的物质经水加热煎煮后成分发生变化。

4.4 影响苦味叠加预测的因素

中药汤剂的苦味是多种成分的集中表达，本实验对不同类型苦味中药DCMM 采用二元、三元叠加进行相关苦度测定，由简到繁，初步探索苦味DCMM 的苦度叠加规律。通过结果进行分析发现，影响口尝苦度与电子舌苦度叠加预测的原因可能有，一是质量浓度：单个待测样品浓度合适，但经叠加后溶液中苦味质质量浓度是否已超出电子舌测定范围；二是响应程度：中药水煎液是十分复杂的体系，引发电子舌的传感器响应的物质在测定过程中易受到干扰，与人体味蕾细胞感受到的物质有差异性；三是样品组成个数：本实验中随着样品中含有的饮片越多，口尝苦度和电子舌苦度相关性越差。后期需通过增加实验设计水平数（样本测试数）、优化浓度梯度以降低实验偏差，提高模型精确度。

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