微波-无水氯化钙真空干燥联合脱除水飞蓟素中残留乙醇的研究

＊陈家宝 李爽 田丽敏 刘慧

（武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程教育部重点实验室 湖北 430205）

水飞蓟素是一类传统的肝脏疾病辅助治疗药物[1]，最早是由Wagner等科学家从菊科草本植物水飞蓟的果实和种子中提取出来的一类天然活性成分，该药物在南欧、北非较为流行，我国于1972年引进栽培水飞蓟。水飞蓟素具有良好的药理活性，除了具有保肝、护肝的功效外，对一些神经系统疾病，如阿尔兹海默症等都有较好的治疗效果。水飞蓟素主要包括水飞蓟宾、水飞蓟宁、异水飞蓟宾等四种异构的黄酮类成分，被称为“天然的护肝药”，其中，水飞蓟宾含量最高，占到了60%～70%，护肝活性最强[2]。

水飞蓟素是从水飞蓟的果实和种子中提取出来的有效成分，传统药用植物的活性组分一般比较复杂，由于其活性成分的特殊性，其分离、提取、纯化的工艺也比较复杂。传统的分离、提取方法有溶剂提取法和水蒸气蒸馏法，近年来，一些超临界流体的发现，促进了超临界流体萃取技术的发展，新型的半仿生提取和酶工程技术也有所突破，目前在工业上，根据水飞蓟素易溶于丙酮、乙醇以及乙酸乙酯等有机溶剂的溶解特性，主要是通过机械压榨出脂肪（油）后，再溶于丙酮、乙醇以及乙酸乙酯等有机溶剂中，加热回流，经过多次萃取、洗脱、重结晶来提取有效组分[3]。其中，乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂作为一种溶剂应用于水飞蓟素的提取、重结晶工艺中，作为第三类溶剂，根据《中国药典》2020版以及人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）的规定，乙醇的溶剂残留限度不得超过0.5%。干燥、沸腾干燥、真空干燥等方法都能有效除去残留乙醇，随着当代膜分离技术的发展，渗透汽化在脱醇技术上有着巨大的应用潜力。

微波是一种常见的电磁波，波长在0.1mm到1m之间，微波干燥技术是一种通过微波辐照，物体内外同时受热，使物体内部迅速产生蒸气，形成压力梯度从而产生推动力加快物料干燥的一种方法。因为微波加热是体热源加热，在没有其它辅助热源的情况下，一般其内部温度都会高于表面温度[4]。微波干燥技术在许多行业都已经广泛应用，20世纪60年代初，国外就报道了许多微波干燥技术及原理的文献，我国在微波干燥技术方面起步较晚，与国外有一定差距，但在食品、医药等行业也取得了重大突破。研究表明，若将物料平铺，热能会迅速累积，达到迅速干燥的效果。传统的热干燥技术（如热风干燥、蒸汽干燥等）存在着对环境不友好，污染严重，设备容易锈蚀等缺点，相比较来言，微波干燥技术具有绿色、环保的特点，其干燥速度快，可在较低的干燥环境下对物料进行加热，从内部加热等特点能有效避免表皮过热，烤焦等情况，不破坏物料。随着全球变暖日益严重，近年来我国也加入到“碳中和”“碳达标”等新理念中，全球对节能减排的呼吁导致能源结构发生改变，与传统的干燥技术相比，微波干燥的优势非常明显的体现出来。

工业上在用乙醇提取、重结晶水飞蓟素的过程中，乙醇被包裹在水飞蓟素中或是与水飞蓟素共同构成晶体从而在产品中残留下来，我们通过微波干燥和无水氯化钙真空干燥联用的方法脱除水飞蓟素中的残留乙醇，首先利用微波辐照，使水飞蓟素中的微分子进行震动，将包裹的乙醇释放出来，释放出来的乙醇一部分直接受热挥发脱除，一部分继续吸附在水飞蓟素表面。吸附在水飞蓟素表面的残留乙醇，使用无水氯化钙真空干燥的办法脱除，无水氯化钙是一种常见的干燥剂，乙醇分子中氧的孤电子对和氯化钙游离离子的空轨道形成配位键，所以利用氯化钙和乙醇可以形成结晶醇的机理，将微波辐照过后的水飞蓟素加入到无水氯化钙的真空干燥器中，残留在水飞蓟素表面的乙醇在低压下挥发，同真空干燥器中的无水氯化钙形成结晶醇，从而达到除去乙醇的目的。

1.仪器与试剂

Ganlanz G80F20CN1L-DG（W0）微波炉，真空干燥器（成都蜀牛科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，红旗Y-60真空表，Agilent 7890气相色谱仪，Agilent7697A顶空进样装置，配有Agilent操作控制及积分软件，NHA-300氮氢空一体机，AB204-N分析天平（南京安铎贸易有限公司），傅里叶红外光谱分析仪（WQF-510A/520A），甲醇、乙醇、DMF均为色谱纯，无水氯化钙，样品为水飞蓟素（辽宁沃德药业样品，乙醇含量为0.5043%）。

2.试验步骤

(1)微波干燥水飞蓟素

精密称取来自工厂样品的乙醇含量不达标的水飞蓟素产品1.0000g，将称取完的水飞蓟素均匀平铺在培养皿中，使其在培养皿中是足够薄的一层，将培养皿放置于微波炉中进行微波辐照，即得到微波干燥后的水飞蓟素初品。

(2)真空干燥水飞蓟素

在真空干燥器底层加入适量的无水氯化钙，将处理后的水飞蓟素初品于培养皿中一起置于真空干燥器中干燥，连接上循环水式真空泵抽真空至真空度为0.1MPa，干燥48h以上，期间多次重复抽真空，保持真空度，得到的样品用顶空-气相色谱法检测其乙醇残留量。

(3)仪器分析

干燥好的样品通过顶空进样方法进行气相色谱分析：

精密称取甲醇适量，加DMF溶解稀释成每毫升含3mg甲醇的内标溶液，精密称取乙醇（色谱纯）适量，加内标溶液稀释成每毫升含2.5mg乙醇的对照溶液。精密称取乙醇适量至10mL容量瓶中，加入内标溶液稀释成乙醇浓度为0.025μg/mL、0.25μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL的标准溶液。精密称取干燥好的水飞蓟素样品0.5g加入到顶空瓶中，加已配好的内标溶液1mL溶解，顶空瓶预热进样。

以KBr压片法进行红外光谱分析。

3.色谱条件

色谱柱：以5%二苯基-95%甲基聚硅氧烷为固定液的HP-5弹性石英毛细管柱（Agilent19091J-413，30m×320μm，i.d，0.25μm）；柱温：初始温度为40℃，维持6min，采用程序升温以每分钟15℃升温至180℃，维持3min，采用氢火焰离子化检测器（FID），检测器温度为250℃。载气：高纯氮，流速为1.7mL/min，分流比为1∶10。顶空预热温度为85℃，预热时间为20min，传输管温度为95℃，进样口温度为105℃。

4.均匀试验设计

以水飞蓟中残留乙醇含量为指标，应用2因素6水平均匀设计法，探究微波功率、辐照时间对水飞蓟中残留乙醇含量的影响。按照U6（62）因素水平表进行试验。因素水平表见表1，表2是常见的6因素6水平均匀设计表。

表1 因素水平Tab.1 Level of factor

表2 U6（66）均匀设计表Tab.2 Homogeneous design on U6(66)

利用均匀设计表来安排实验，在探究不同因素对于水飞蓟中残留乙醇含量的影响时，选取微波功率、微波辐照时间2因素，每个因素选取6个水平，即选取均匀设计表2中的前两列进行实验安排，详细的微波辐照时间及功率均匀设计安排表见表3。

表3 微波辐照时间及功率均匀设计表Tab.3 Uniform design of microwave irradiation time and power

5.结论与分析

(1)线性关系考察

分别取试验步骤3中标准溶液各1.0mL于6个顶空瓶中依次进样，通过积分确定峰面积，以乙醇浓度为横坐标，乙醇与甲醇的峰面积比值为纵坐标绘制标准工作曲线，计算得线性方程为Y=0.5392X-0.02837，r=0.9999，残留乙醇浓度在0.025～20.0μg/mL内，线性关系良好。

(2)均匀试验设计结果与分析

按照表3，分别在微波功率0～800W、微波辐照时间1～6min中选取6个水平进行实验，实验结果如表4所示：

表4 实验结果表Tab.4 Experimental results

续表

从表4的数据结果可以看出，6号样的残留乙醇含量最低，其辐照时间及微波功率也较高。

(3)数据处理

组别4是在微波功率水平为0，即结果是未经处理过的水飞蓟中的残留乙醇，其作为对照组，对其它5组实验数据进行分析，利用IBM SPSS Statistics22.0统计软件，进行线性回归分析，结果如表5所示。

表5 线性回归分析结果Tab.5 Linear regression analysis results

从表5可知，将辐照时间（min），微波功率（%）作为自变量，而将残留乙醇（%）作为因变量进行线性回归分析，从上表可以看出，模型公式为：残留乙醇（%）=0.524-0.024×辐照时间（min）-0.001×微波功率（%），模型R2为0.990，对模型进行F检验时发现模型通过F检验（F=102.924，p=0.010＜0.05）也就是说明微波辐照时间及功率最少有一项会对水飞蓟素中残留乙醇的量产生影响，总回归效果显著。

辐照时间（min）的回归系数值为-0.024（t=-8.187，p=0.015＜0.05），微波功率（%）的回归系数值为-0.001（t=-7.771，p=0.016＜0.05），意味着辐照时间（min），微波功率（%）均会对残留乙醇（%）产生显著的负向影响关系。

(4)红外谱图分析

图1为实验中在利用微波-无水氯化钙真空干燥联合脱除水飞蓟素中残留乙醇前和后水飞蓟素的通过KBr压片法进行红外分析得到的谱图。图1中显示，使用微波和无水氯化钙真空干燥联用后得到的乙醇残留达标的水飞蓟素红外吸收光谱图与未处理前过的乙醇残留不达标得水飞蓟素红外吸收光谱图并无明显变化，说明水飞蓟素的化学分子结构未发生变化。

图1 处理前后水飞蓟的红外谱图Fig.1 Infrared spectra of Silybum marianum before and after treatment

(5)结果与讨论

以微波辐照和无水氯化钙真空干燥联用的方法处理水飞蓟素，在对微波功率和辐照时间双因素进行试验的基础上，采用均匀设计法研究其对残留乙醇含量的影响。通过顶空-气相色谱法检测结果表4可以看出，在微波功率为0～800W之间，辐照时间1～6min之内的条件下进行微波干燥时，其在640W，微波辐照6min条件下，乙醇提取的比较彻底，为最优条件。该方法使用纯物理手段进行残留溶剂的脱除，不引入新的杂质；在合适的微波条件下对水飞蓟素的结构不造成较大的破坏；操作简单，成本损耗低，易于工业化，绿色无污染。该实验研究可为食品、药品行业除残留溶剂提供参考依据，为新型干燥技术的提高与完善提供研究基础。