注入-超声法制备苍艾挥发油醇质体的工艺研究

朱 煜，熊 磊，马云淑，3，4*，陈庆飞，3，赵梦芸，3(.云南中医药大学，昆明 650500；2.云南省第三人民医院，昆明 6500；3.云南省高校外用给药系统与制剂技术重点实验室，昆明 650500；4.云南省傣医药与彝医药重点实验室，昆明 650500)

苍艾挥发油组方是熊磊教授治疗上呼吸道疾病的临床经验方，主要是由苍术、艾叶和丁香等7味中药粗粉采用水蒸气蒸馏法提取得到的复方挥发油，其气味芳香，具有开窍、燥湿和化浊的功效。课题组前期研究表明，苍艾挥发油对金黄色葡萄球菌和乙型链球菌有一定的体外抑菌作用，且对治疗上呼吸道感染有良好的作用[1]，同时能有效抑制肺气虚证大鼠肺部和咽部黏膜的炎症反应，修复创伤黏膜组织[2]，并有望在抑郁症的治疗中发挥良好的效果[3]。陈柏君等[4]对苍艾挥发油化学成分进行GC-MS分析，结果显示,其中含量较多的2个成分为丁酚香和1，8-桉叶素，分别占42.43%，30.80%。挥发油性质不稳定，易受光线、氧气、温度和湿度的影响，可能使其颜色变深，比重和黏度增大，从而降低药效。

醇质体作为新一代脂质体，是由磷脂、高体积分数乙醇(或丙二醇等)和水组成的具囊泡结构的给药载体。与普通脂质体相比，其结构稳定、包封率较高、粒径较小，有更好的膜流动性，在皮肤真皮层药物滞留量更多，易于携带。药物可透过皮肤角质层或黏膜细胞，是良好的皮肤与黏膜给药载体[5-7]，在局部和全身治疗方面具有很好的应用前景。故本实验应用正交实验设计优化苍艾挥发油醇质体的制备工艺，以提高挥发油的稳定性，保证制剂质量，减少皮肤和黏膜刺激性，延长药效，为中药挥发油外用制剂的研制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 CP124C型电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；Brookhaven型激光粒度仪(美国布鲁克海文仪器公司)；FS-300N型超声波处理器(上海生析超声仪器有限公司)；UV-2450型紫外扫描仪(日本岛津公司)；UV-6000T型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；JEM-2100型透射电子显微镜(日本电子株式会社)；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2试药 苍艾挥发油，实验室自制；苍术、艾叶、花椒、藿香、佩兰、丁香和白豆蔻药材(批号分别为181201，170343，182516，183121，171153，180789，181304)，均购自云南自然谷生物开发有限公司；大豆卵磷脂(批号613M023)，北京索莱宝科技有限公司；石油醚(批号20151103)，成都市科隆化学品有限公司；丁香酚对照品(质量分数≥99.6%，批号201716)，中国食品药品检定研究院；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1苍艾挥发油醇质体的制备 采用注入-超声法制备苍艾挥发油醇质体。精密称取处方量的苍艾挥发油、大豆卵磷脂和无水乙醇，置于棕色西林瓶中，40 ℃环境下用磁力搅拌器以200 r·min-1搅拌0.5 h，然后向西林瓶中缓慢、匀速滴加40 ℃纯净水3.5 mL，搅拌至充分溶解并将其移至10 mL离心管中，冰水浴探头超声：45 W 2 min→75 W 2 min→105 W 2 min→135 W 2 min，最后用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得质量浓度为0.1 g·mL-1的苍艾挥发油醇质体。

2.2苍艾挥发油紫外测定波长的确定 取苍艾挥发油，用适量甲醇稀释，在200～800 nm波长范围内进行紫外扫描，结果表明，苍艾挥发油在280 nm波长附近有最大吸收峰，故确定280 nm为其测定波长。

2.3苍艾挥发油醇质体包封率的测定 包封率是指醇质体中被包载的药物量在总投药量中所占的比例，是衡量醇质体质量的重要指标。本实验采用石油醚萃取-紫外法[8]测定苍艾挥发油醇质体的包封率，吸取适量2.1项下制备的苍艾挥发油醇质体，加甲醇破乳，定容，于280 nm波长处检测其吸光度值A，记为A1；另取同体积苍艾挥发油醇质体，加同体积石油醚萃取3次，取下层醇质体层加甲醇破乳，定容，于280 nm波长处检测其吸光度值A，记为A2，计算包封率：包封率=A2÷A1×100%。

2.4方法学考察

2.4.1溶液的配制 精密称取苍艾挥发油0.01 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容、摇匀，即得质量浓度为1 mg·mL-1的苍艾挥发油甲醇储备液；取苍艾挥发油甲醇储备液0.2,0.4，0.6 mL，分别经甲醇稀释10倍，即得质量浓度分别为20，40，60 μg·mL-1的苍艾挥发油甲醇溶液。另取苍艾挥发油0.01 g，置于10 mL量瓶中，以石油醚定容、摇匀，即得质量浓度为1 mg·mL-1的苍艾挥发油石油醚储备液。取2.1项下制备的质量浓度为0.1 g·mL-1的苍艾挥发油醇质体2，4，6 μL，分别用甲醇稀释10倍，即得质量浓度分别为20，40，60 μg·mL-1的苍艾挥发油醇质体甲醇溶液。同2.1项下方法，不加苍艾挥发油，得空白醇质体，再以适量甲醇稀释，即得空白醇质体甲醇溶液。取丁香酚对照品适量，以甲醇溶解，即得丁香酚对照品溶液。

2.4.2专属性考察 分别取2.4.1项下制备的质量浓度为40 μg·mL-1的苍艾挥发油甲醇溶液、40 μg·mL-1苍艾挥发油醇质体甲醇溶液、空白醇质体甲醇溶液以及丁香酚对照品溶液，在200～800 nm波长范围内进行紫外扫描，结果见图1。由图1可知，空白醇质体甲醇溶液在280 nm波长处无吸收峰，对苍艾挥发油指标性成分丁香酚的测定无干扰。

图1 紫外扫描图

2.4.3标准曲线的建立 分别量取2.4.1项下制备的苍艾挥发油甲醇储备液和苍艾挥发油石油醚储备液各0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50 mL，分别置于16个10 mL量瓶中，分别加甲醇和石油醚定容，摇匀，于280 nm波长处检测，以吸光度值A为纵坐标(y)、溶液质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，得方程：y1=0.015 5x1-0.077 9(R12=0.999 7)，y2=0.014 5x2-0.010 3(R22=0.999 1)，2种溶液质量浓度均在15.00～50.00 μg·mL-1范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2.4.4精密度实验 分别取2.4.1项下制备的质量浓度分别为20，40，60 μg·mL-1的苍艾挥发油甲醇溶液和苍艾挥发油醇质体甲醇溶液，各3份，分别于280 nm波长处连续测定其吸光度值A。结果3种质量浓度的苍艾挥发油甲醇溶液的RSD值分别为0.09%，0.08%，0.09%，3种质量浓度的苍艾挥发油醇质体甲醇溶液的RSD值分别为0.30%，0.20%，0.09%，表明仪器精密度良好。

2.4.5稳定性实验 分别取2.4.1项下制备的质量浓度均为40 μg·mL-1的苍艾挥发油甲醇溶液和苍艾挥发油醇质体甲醇溶液，于第0，2，4，6，8，10，12 h在280 nm波长处测定其吸光度值A，2种溶液的RSD值分别为0.80%，0.25%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.6重复性实验 取2.1项下同批次苍艾挥发油醇质体6份，分别用甲醇稀释至质量浓度为40 μg·mL-1，在280 nm波长处测定其吸光度值A，RSD值为0.36%，表明实验重复性良好。

2.4.7苍艾挥发油在石油醚中的回收率 精密量取2.4.1项下制备的不同体积的苍艾挥发油石油醚储备液150，300，450 μL，分别置于10 mL量瓶中，加石油醚定容，配制成低、中、高3个质量浓度的苍艾挥发油石油醚溶液，分别于280 nm波长处测定吸光度值A；另取不同体积的苍艾挥发油石油醚储备液150，300，450 mL，分别加适量空白醇质体，物理混合，用同体积石油醚萃取3次，取上层石油醚定容至10 mL量瓶中，分别于280 nm波长处测定吸光度值A。结果表明，3个质量浓度的苍艾挥发油石油醚溶液中的苍艾挥发油的平均回收率在100.04%～100.10%范围内，RSD值均小于1.53%，表明游离药物与醇质体可以较好地分离[8]。

2.4.8苍艾挥发油在空白醇质体中的回收率 精密量取2.4.1项下制备的不同质量浓度的苍艾挥发油甲醇储备液，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成低、中、高3个质量浓度的苍艾挥发油甲醇溶液，分别于280 nm波长处测定吸光度值A；另取不同体积的苍艾挥发油甲醇储备液，加适量空白醇质体，混合，再加甲醇破乳，定容至10 mL，分别于280 nm波长处测定吸光度值A。结果表明，3个质量浓度的苍艾挥发油甲醇溶液中的苍艾挥发油的平均回收率在99.50%～100.60%范围内，RSD值均小于0.65%，表明空白醇质体对苍艾挥发油的吸光度值A无明显影响[8]。

2.5正交实验设计及结果 在单因素考察和大量预实验的基础上，选择对苍艾挥发油醇质体包封率影响较大的乙醇体积分数(A)、大豆卵磷脂质量分数(B)和乳化温度(C)为考察因素，空白因素(D)作为误差项，各因素选取3个水平，以包封率为评价指标，设计L9(34)正交实验，因素与水平见表1，实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交实验因素与水平

表2 正交实验结果

表3 方差分析结果

由表2和表3可知，3个因素对苍艾挥发油醇质体包封率的影响顺序为A>C>B，其中乙醇体积分数(A)和乳化温度(C)对醇质体的包封率有显著影响，故选择最优方案A2C3，出于经济性考虑，选择大豆卵磷脂质量浓度(B)为B1方案，因此确定制备苍艾挥发油醇质体的优选工艺为A2B1C3，即固定苍艾挥发油质量分数为10%，乙醇体积分数为30%，大豆卵磷脂质量分数为1.8%，乳化温度为40 ℃。

2.6优选工艺验证 按照2.5项下优选工艺制备3批苍艾挥发油醇质体，按照2.3项下方法测定包封率，3批苍艾挥发油醇质体的平均粒径为(78.64±1.05) nm，平均包封率为82.23%±1.16%，该制备工艺稳定，重复性较好。

2.7苍艾挥发油醇质体的质量评价

2.7.1表观形态 取2.1项下制备的苍艾挥发油醇质体，日光下观察呈乳白色半透明溶液。另取适量苍艾挥发油醇质体稀释数倍，滴于铜网上，用磷钨酸负染，晾干，透射电镜下观察其形态并拍照，可见苍艾挥发油醇质体呈类圆形囊泡，表面光滑，大小分布均匀，见图2。

图2 透射电镜图

2.7.2粒径及Zeta电位 取2.1项下制备的苍艾挥发油醇质体，在常温第0和15天分别用0.5 mL纯净水稀释25倍，用激光粒度仪在20 ℃下测定其粒径及Zeta电位，结果见表4。由表4可知，优选工艺制得的苍艾挥发油醇质体在常温下放置15 d后，粒径和Zeta电位无明显改变。

表4 粒径及Zata电位

3 讨论

醇质体常用的制备方法有薄膜分散法[9-10]、注入法[11-12]和注入-超声法[13-14]等。本实验所用的注入-超声法是在注入法的基础上，将脂溶性的苍艾挥发油和大豆卵磷脂先溶于乙醇中，注入纯水，并将所得的溶液用冰水浴探头超声后，再用微孔滤膜过滤，使制得的苍艾挥发油醇质体匀质化，体系较稳定。本实验所制得的苍艾挥发油醇质体在常温中保存15 d后，外观形态仍为乳白色半透明液体，无沉淀、无油水分离现象，粒径和Zeta电位无明显变化。此制备工艺操作简单可行，条件易控制，适用于大量醇质体的制备，有利于投入工业化生产，但在制备过程中应谨慎处理每一个步骤，如乙醇、纯水注入的速度一定要缓慢且匀速，滴入速度不超过20滴·min-1。

醇质体包封率的测定方法常采用凝胶柱色谱法[15-16]、透析法[17-18]、超速离心法[19-20]和萃取法[8]等。其中，凝胶柱色谱法常用的凝胶为水溶性凝胶，透析法常用的透析介质为水溶液。考虑到苍艾挥发油脂溶性强，故不适宜采用凝胶柱色谱法和透析法，故选用石油醚萃取法。本实验还分别考察了苍艾挥发油在石油醚和空白醇质体中的回收率，结果表明，石油醚萃取分离游离药物的方法可行，实验成本较低，方法重复性较好。研究表明，乙醇对皮肤和黏膜有轻微毒性，还应对该制剂的皮肤刺激性和纤毛毒性进行研究。

醇质体作为一种高效的经皮和经鼻腔给药载体，随着醇质体促渗机制研究的不断深入，在中药复方现代制剂中的应用将更加广泛。