一测多评法测定补骨脂中5种成分的含量

段 丽，祝清灿，汪 娥，孙宜春(国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 550026)

中药补骨脂为豆科(Leguminosaesp.)植物补骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果实，味苦、气辛、性温，归肾、脾经，具有温肾助阳、纳气平喘和温脾止泻的功效[1]。在中医临床上主治肾虚泄泻、遗精、阳萎、尿频数、腰膝冷痛和虚寒喘咳等症。现代研究表明，补骨脂中含香豆素类、单萜酚类、黄酮类以及苯并呋喃类等多种化学成分，且药理作用广泛，具有抗肿瘤、抗菌、抗骨质疏松和抗雌激素样作用等多种药理活性[2-8]。《中国药典》2015年版中含补骨脂的成方制剂达41种，但仅以补骨脂素和异补骨脂素的含量为补骨脂的质量控制指标[1]。中药成分复杂，多成分多靶点共同起到防病治病的作用，仅通过检测其中的个别成分以评价其质量略显不足。多指标同时测定，需要多个对照品[9-13]。一测多评法(QAMS)[14]只需1个对照品，即可同时测定其他成分的含量，可解决某些对照品难以获得或价格高的问题，具有简便、高效的特点。本文建立能测定补骨脂药材中补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮和补骨脂酚含量的QAMS法，为补骨脂的质量、安全性评价和质量标准的提升提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Vanqish型超高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；Agilent 1290型超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；Direct-Pure Genie型超纯水系统(上海乐枫生物科技有限公司)。

1.2试药 补骨脂素(批号110739-201617)、异补骨脂素(批号110738-201617)、新补骨脂异黄酮(批号520052-201401)和补骨脂二氢黄酮对照品(批号520053-201401)，均购于中国食品药品检定研究院，质量分数均>99%；补骨脂酚对照品(批号BCY-000053)，购于江西佰草源生物科技有限公司，质量分数≥98%；乙腈和甲醇(色谱纯)，购于美国Fisher公司；水为超纯水，实验室自制。实验用15批补骨脂样品来源见表1，经贵州中医药大学李伟教授鉴定为豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实。

表1 15批补骨脂的样品来源

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用Zorbar RRHD SB-C18(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Shim-pack XR-ODSⅢ C18(150 mm×2.0 mm，2.2 μm)色谱柱。流动相：乙腈(A)-2 mL·L-1冰醋酸(B)；流速0.4 mL·min-1。梯度洗脱(0～0.5 min，23%A～26%A；0.5～1.2 min，26%A；1.2～1.9 min，26%A～35%A；1.9～5.0 min，35%A～40%A；5.0～8.0 min，40%A～55%A；8.0～10.0 min，55%A；10.0～13.0 min，55%A～75%A；13.0～13.5 min，75%A；13.5～15.8 min，75%A～95%A；15.8～16.5 min，95%A；16.5～18 min，95%A～23%A；18～20 min，23%A)。检测波长：246 nm；柱温：45 ℃[15-16]。

2.2溶液的配制

2.2.1混合对照品溶液 分别精密称取补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮对照品13.00，12.50，12.7，10.60 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得4种成分质量浓度分别为1.30，1.25，1.27，1.06 mg·mL-1的单一对照品储备液；取补骨脂酚对照品适量，置于量瓶中，再分别精密量取上述单一对照品储备液，加甲醇稀释配制成5种成分质量浓度分别为65.00，62.50，44.45，53.00，0.64 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 精密称取补骨脂样品粉末(过3号筛)0.5 g，置于索氏提取器中，加甲醇90 mL，水浴回流提取2 h，放冷，移至100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液 取甲醇适量，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3系统适用性实验 分别取2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各2 μL，注入液相色谱仪，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。由图1可知，各主成分分离度较好，阴性样品在相应位置上无吸收峰，表明阴性对照无干扰。

根据航运公司公布的运输费用、时间及对服务水平的定性描述，得到各路径的运输费用、时间、各路径对应的服务水平等级等相关数据，具体如表2所示.

图1 HPLC图

2.4线性范围 将2.2.1项下制备的混合对照品溶液加甲醇稀释成系列质量浓度的溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，以对照品的质量浓度为横坐标(x)、峰面积积分值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并进行线性回归。计算得5种成分的线性方程分别为y1=0.727 7x1+1.186(r1=0.999 9)，y2=0.715 5x2+1.178(r2=0.999 9)，y3=0.448 5x3+0.213(r3=1.000 0)，y4=0.197 5x4+0.214(r4=1.000 0)，y5=0.186 9x5+0.449(r5=0.999 9)。结果表明，5种成分的质量浓度分别在3.20～320.23，2.70～312.91，2.20～219.45，2.72～271.76,1.60～320.68 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5精密度实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件1 d内连续进样6次，记录各色谱峰峰面积并计算RSD值，测得5种成分日内精密度RSD值分别为0.23%，0.18%，2.02%，2.20%，0.30%；连续进样3 d，每日进样6次，测得日间精密度RSD值分别为1.38%，1.42%，1.81%，2.02%，0.30%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性实验 取同一批补骨脂药材(批号20161001)，按照 2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录各色谱峰峰面积并计算RSD值，结果5种成分的峰面积RSD值分别为 0.93%，0.94%，0.92%，1.12%，0.57%，表明该方法重复性良好。

2.7稳定性实验 取2.2.2项下制备的供试品溶液，分别于0，1，2，6，8，12，16，24 h按照2.1项下色谱条件进样测定，记录各色谱峰峰面积并计算RSD值，测得5种成分的峰面积RSD值分别为0.34%，0.19%，0.45%，2.35%，0.39%，表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。

2.8回收率实验 精密称取已知含量的同批号(批号20161001)补骨脂药材0.25 g，9份，分别置于索氏提取器中，分别精密加入2.2.1项下制备的混合对照品溶液0.8，1.0，1.2 mL，各3份，使待测目标成分对照品的加入量相当于样品含有量的80%，100%，120%，加入90 mL甲醇，水浴回流3 h，取出，移至100 mL量瓶中，加甲醇定容，0.22 μm滤膜过滤，按照2.1项下色谱条件进样测定。记录各色谱峰峰面积并计算平均回收率和RSD值，结果见表2。

2.9相对校正因子(RCFs)的计算 RCFs值的计算公式为[13]：fis=fi÷fs=(Ai÷Ci) ÷(As÷Cs)，式中As为内参物的峰面积，Cs为内参物质量浓度，Ai为待测成分峰面积，Ci为待测成分质量浓度。

取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，分别进样1，2，5，10，15，20 μL，记录各成分色谱峰峰面积，分别以补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮和补骨脂酚为内参物，计算其他4种成分的RCFs，取其平均值作为各自的RCFs，对应的RSD值分别为0.79%，0.94%，0.98%，0.86%，2.26%。结果显示，以补骨脂素为内参物，其余待测成分RCFs所对应的RSD值最小，且补骨脂素符合内参物的筛选原则，故选择补骨脂素作为内参物。

表2 回收率实验结果 (n=9)

2.10.1RCFs的重复性 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液6份，按照2.1项下色谱条件进样测定，以补骨脂素为内参物，分别计算其余4种成分的RCFs值所对应的RSD值。结果4种成分的RSD值均在0.15%～0.81%范围内，表明RCFs的重复性良好。

2.10.2不同仪器和色谱柱对RCFs的影响 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别考察Thermo Vanquich UPLC(A)和 Agilengt 1290 UPLC (B)2种色谱仪以及Zorbar RRHD SB-C18(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)(C)和Shim-pack XR-ODS Ⅲ C18(150 mm×2.0 mm，2.2 μm)(D)2种不同色谱柱对RCFs值的影响。结果显示，各待测成分RCFs值所对应的RSD值均小于2.86%，表明不同色谱系统及不同色谱柱对RCFs无明显影响。结果见表3。

表3 不同仪器和色谱柱对RCFs的影响 (n=6)

2.11待测组分色谱峰的定位 取2.2.1项下制备

的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别考察2种色谱仪和2种不同色谱柱(同2.10.2项下)对相对保留值(RRT)的影响。测定并计算4种待测成分与内参物补骨脂素的RRT，结果见表4。由表4可知，各成分RRT所对应的RSD值均小于2.65%，表明利用RRT进行不同成分色谱峰的定位是可行的。

表4 不同仪器和色谱柱对RRT的影响 (n=6)

2.12QAMS法与外标法测定结果的比较 将15批补骨脂药材按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，各2份，按照2.1项下色谱条件进样测定。分别采用外标法和QAMS法计算 15 批补骨脂药材中 5 种成分的含量，结果见表5。由表5可知，5种成分含量分别在0.26%～0.72%，0.25%～0.63%，0.25%～0.42%，0.14%～0.34%，3.43%～5.92%范围内，经t检验及配对设计的Wilcoxon符号秩和检验证明2 种方法所测结果差异无统计学意义；外标法实测值与QAMS法计算值的相对误差<5%，说明QAMS法可作为补骨脂多指标成分质量的评价方法。

表5 补骨脂中5种成分的含量 (n=2)

3 讨论

3.1耐用性考察 参考文献[15-20]进行不同色谱柱、柱温、流速及液相色谱仪的考察，色谱图均得到良好重现，分离度、对称因子等均达到相关要求。不同柱温及流速下各待测成分RCFs所对应的RSD值均小于0.76%，柱温流速等对RCFs影响较小。

3.2供试品溶液的制备方法考察 考察了超声、回流及索氏提取3种方法对提取效果的影响，结果表明，索氏提取法节约溶剂且各成分含量均较高，故选择该方法制备供试品溶液。

3.3评价指标的选择 通过查阅相关文献[2-8]及测定15批补骨脂药材中5种成分的含量，结果各批药材中5种成分的含量均大于0.1%，依据文献选择含量大于0.1%的5种成分作为评价指标[14]，最终确定补骨脂中4种成分对补骨脂素的RCFs分别为:

f异补骨脂素/补骨脂素=1.01，f新补骨脂异黄酮/补骨脂素=0.61，

f补骨脂二氢黄酮/补骨脂素=0.29，f补骨脂酚/补骨脂素=0.28；

RRT值：

r异补骨脂素/补骨脂素=1.06，r新补骨脂异黄酮/补骨脂素=1.68，

r补骨脂二氢黄酮/补骨脂素=1.75，r补骨脂酚/补骨脂素=2.72。

本实验在进行QAMS法与外标法测定补骨脂中5种成分含量的比较时，首先对补骨脂中5种成分间的RCFs和RRT值进行了验证，分别采用2种方法对待测成分进行色谱峰定位和含量测定。实验结果表明，本实验所确定的RCFs和RRT结果准确、可靠，可用于计算补骨脂中其他4种成分的含量。