小柴胡汤抗丙型肝炎病毒机制的实验研究

田昆仑，杨志华，苏娟，李建蓉

（1.大理大学第一附属医院临床医学院，云南 大理 671000；2.大理大学基础医学院生理学与病理生理学教研室，云南 大理 671000；3.华中科技大学同济医学院病原生物系，湖北 武汉 430030）

HCV 主要经血液或血制品传播，占输血后肝炎的80%～90%，目前全球有1.7 亿人感染HCV，我国健康人群抗HCV 阳性率为0.7%～3.1%，约3 800 万人，且发病率呈逐年上升趋势。由于丙肝初始症状不明显，不易被发觉，且疾病隐匿性发展，因而比乙肝更易演变为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。西医治疗以干扰素为主要药物，但其临床完全应答率仅为50%左右。小柴胡汤具有消炎、保护细胞膜的作用，被广泛用于治疗慢性肝病[1]。本研究旨在探讨小柴胡汤抗丙型肝炎病毒（HCV）的作用机制，并通过动物实验，观察药物对机体免疫功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取6～8周龄清洁级ICR小鼠40只，体质量18～22 g，平均体质量（20.3±2.2）g，随机分为给药组和对照组，每组20只。8～9周龄清洁级SD大鼠，体质量200 g左右，由同济医学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物给药 小柴胡汤组方：柴胡9 g、黄芪6 g、半夏6 g、党参6 g、生姜6 g、炙甘草3 g和大枣4枚。上述材料购自武汉市中药材公司，药物煎煮2次，合并2次煎煮液过滤浓缩，1 mL 溶液相当于原生药1 g，置4 ℃保存备用。给药组给予15 g/kg（ig）试药，对照组给予等量0.9%氯化钠溶液，每天给药2次，连续给药10 d。

1.2.2 淋巴细胞增殖试验（采用MTT法） 第11天处死小鼠，无菌取脾脏，常规分离淋巴细胞，采用10 μg/mL ConA，培养68 h，培养结束前4 h，加入四甲基偶氮唑盐（MTT）1 mg/mL，每孔50 μL，继续培养4 h，弃上清，加入细胞裂解液每孔100 μL，37 ℃放置过夜，在酶标仪570 nm 波长下测定A 值，以反应细胞增殖程度。

1.2.3 T细胞亚群（L3T4＋、Lyt2＋）检测 无菌取小鼠胸腺，分离淋巴细胞，采用间接免疫荧光法测定L3T4＋、Lyt2＋细胞亚群，试剂购自华美生物工程公司。

1.2.4 药物血清的制备[2]用煎煮药方给予15 g/kg 灌喂大鼠，于1次给药后1、2 h，2次给药后1 、2 、3 h采血，分离血清，56 ℃灭活，-20 ℃保存待用。

1.2.5 PBK-HCV 重组体 1 693 bp HCV cDNA片段（核苷酸序号为317-2009nt）和SMMC7721肝癌细胞由浙江大学医学院传染病研究所提供。主要试剂：RPMI-1640培养基、M-MLV逆转录酶、Oligod（T）16，为美国GIBCOBRL公司生产。β-action和HCV上下游引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列为：β-action1 5’TTCCAGCCTTCCTTCCTGG 3’825 nt～843 nt；β-action2 5’TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT 3’1 029 nt～1 048 nt；HCV-CI1 5’GGTCGCAACCTCGTGGAAGG 3’493 nt～512 nt；HCVCI2 5’ATCGATGACCTTACCCAAAT 3’682 nt～701 nt。

1.2.6 药物半数抑制剂量（ID50） 采用MTT 法，处于对数生长期的SMMC7721肝癌细胞加生药或药物血清处理68 h，每孔MTT 50 μL，继续培养4 h，弃上清，加入二甲亚砜（辽宁德迈世欧化工有限公司）每孔100 μL，摇匀，于酶标仪570 nm波长下测定A 值，计算出半数抑制剂量（ID50），小柴胡汤为75 mg/mL。

1.2.7 细胞转染和RNA 提取 重组体PBK-HCV 转染SMMC7721肝癌细胞，采用FUGENETM6转染试剂[普洛麦格（北京）生物技术有限公司]，严格按说明书操作，在转染后24 h 加入不同生药浓度（低于抑制细胞增殖浓度以下取3 个药物浓度，分别为30 、20 和10 mg/mL）或20%药物血清培养液，继续培养48 h，用RNA 抽提试剂（Trizol Reagent）提取细胞总RNA，同时，设置未加药对照组。

1.2.8 HCV mRNA 表达 采用RT-PCR 法测定。采用抽提的RNA 5 μL 作为逆转录模板，在模板中加入5×RT Buffer 5 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，Oligod（T）16100 pmol/L，M-MLV逆转录酶100 U，加双蒸水至25 μL。41 ℃水浴1 h，煮沸变性10 min。取RT扩增产物5 μL，加入10×Buffer 5 μL，2 mmol/L-1dNTP 5 μL，25 mmol/L MgCl 3 μL，βaction 引物或 HCV 引物各 20 pmol/L，TaqDNA 酶 1.5 U，加双蒸水至50 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性2 min，94 ℃预变性1 min，56 ℃预变性1 min和72 ℃预变性1 min，共30个循环，最后72 ℃预变性延伸5 min[3-4]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物对小鼠免疫功能的影响 药物组T淋巴细胞增殖较对照组显著增高，T 细胞亚群比较差异无统计学意义，见表1。

表1 小柴胡汤对ICR小鼠免疫功能的影响（±s）Table 1 Effect of Xiaochaihu Decoction on immune function in ICR mice(±s)

表1 小柴胡汤对ICR小鼠免疫功能的影响（±s）Table 1 Effect of Xiaochaihu Decoction on immune function in ICR mice(±s)

组别对照组（n=20）药物组（n=20）t值P值A570 nm 0.362±0.16 0.798±0.15 1.98＜0.05 L3T4＋34.46±0.87 35.22±1.04 0.56＞0.05 Lyt2＋28.56±0.71 28.96±1.18 0.29＞0.05 L3T4＋/Lyt2＋1.21±0.1 1.22±0.11 0.07＞0.05

2.2 RT-PCR 结果分析 2%琼脂糖凝胶电泳可见224 bp 的β-action条带及209 bp的PBK-HCV的条带，加药组与未加药组均可见2条条带。采用IS-1000多功能凝胶成像仪处理，以HCV-C/β-action表示HCV-mRNA的表达量。结果显示，加药组与未加药组HCV-mRNA表达量比较差异无统计学意义。

3 讨论

丙型肝炎是病毒性肝炎的一种，是一种由HCV感染引起的病毒性肝炎。丙型肝炎的传播途径与乙型肝炎相似，也是经血传播。但是丙型肝炎患者血中的病毒量较少，传染性低于乙肝。丙型肝炎是全球性传染病，在我国也普遍存在，HCV感染后80%～85%患者可发展为慢性肝炎，约20%发展为肝硬化和原发性肝细胞肝癌（HCC）[5]。丙型肝炎病毒HCV 感染的显著临床特点为慢性化发生率高，除约20%的急性感染者可自发清除HCV 外，绝大多数都将发展为慢性持续性感染，并最终进展为肝硬化和肝癌[6]。

目前尚无治疗病毒性肝炎的特效方法。大量用重组干扰素治疗，费用高且疗效不佳。中医中药治疗成为丙型肝炎治疗研究的热点。丙型肝炎具有传染性及潜伏期，其病因为湿热疫毒所致，类似于中医湿温病的范畴，但临床以神疲乏力、纳差为主诉者多见且以脾虚证为主，又类似于中医的内伤脾胃杂症[7]。有关本病辨证论治的报道较乙型肝炎少，早期分型也不统一，分为 2 型、4 型、5 型、6 型、8 型等。1990 年上海会议将慢性肝炎分为5型，具有较强的代表性。归纳各分型特点，涉及脏腑有肝、胆、脾、肾，涉及病理有阴虚、阳虚、气虚、血虚、气滞、血淤、湿热、热毒、寒湿、痰湿等。而临床中又以湿热蕴结，郁久不解，淤滞肝络，肝脾失调，气阴两虚为最主要病理特性[8]。临床上丙型肝炎出现某一个典型证型较少见，通常是几个证型交错互见，在辨证论治中应随证化裁，不必拘泥于一证一方。小柴胡汤治疗病毒性肝炎的疗效已为大量临床应用所证实。现代药学研究表明，柴胡具有抗炎作用，可促进肝脏蛋白质的合成，增加肝糖原，改善高脂血症，防止脂肪肝的形成[9-10]。本研究结果显示，在动物实验中，小柴胡汤组T淋巴细胞增殖显著高于对照组，T细胞亚群比较差异无统计学意义。小柴胡汤对SMMC7721细胞生长的半数抑制剂量为75 mg/mL，但不能抑制重组体mRNA 表达。提示小柴胡汤的抗HCV作用不是通过抑制mRNA的转录，而主要是通过调节机体免疫功能发挥作用。本研究结果还显示，小柴胡汤可增强T细胞转化作用，不影响正常机体的T细胞亚群，具有提高机体细胞免疫功能的作用。

综上所述，小柴胡汤的抗HCV作用不是通过抑制mRNA的转录，而主要是通过调节机体免疫功能发挥作用。