辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠炎性因子表达的影响*

刘 青，孙伯坚，任冬飞，李 林，杨智晖，梁瑞凯

（1.河北省老年病医院，河北 石家庄050021；2.河北医科大学第一医院，河北 石家庄050000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是临床常见的以气流受限为主要特征的慢性呼吸系统疾病，且病情呈进行性发展，发病率及致死率均较高［1-2］。目前，临床认为COPD发病基础为气道慢性炎症，主要累及气道和肺实质，炎性细胞在气道内的浸润会促进气道内黏液分泌，加重炎性反应，造成气道恶性循环，故炎性细胞及其细胞因子在COPD发病过程中扮演重要角色［3-4］。炎性因子包括白细胞介素（IL）家族大部分成员、肿瘤坏死因子（TNF）家族成员及基质金属蛋白等，其中白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素22（IL-22）均参与COPD发病过程，故有效阻断IL-17，IL-22等炎性因子的释放对于减轻炎性反应尤为关键［5-6］。目前，临床对COPD的治疗多以减轻症状、预防感染、抑制病情继续恶化为主，出现重度及极重度气流受限症状的患者常使用糖皮质激素类药物，以减轻气道炎性程度，但长期服用易出现药品不良反应，不利于康复［7-8］。近年来相关研究发现，他汀类药物在COPD的预防及治疗中具有广阔前景，但具体抗炎机制及药理作用尚不清楚［9］。本研究中观察了辛伐他汀对COPD模型大鼠IL-17和IL-22表达的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

1.1.1 仪器

CX32RTSF型显微镜（日本Olympus公司）；RM2235型石蜡切片机、EG1160型石蜡包埋机（德国Leica公司）；MLS-3750型全自动高压蒸汽锅（日本Sanyo公司）；BI-2000型医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）；LHP-400B型培养箱（江苏省金坛市双捷实验仪器厂）。

1.1.2 试药

辛伐他汀（北大医药股份有限公司，批号为20193359，规格为每片20 mg）；10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，批号为20141001）；脂多糖（LPS，美国Sigma公司，批号为L2880）；视黄酸相关孤儿受体γt（RORγt，上海研卉生物科技有限公司，批号为ab219496）；香烟（滁州烟卷厂，规格为每支含尼古丁1.2 mg、焦油19 mg）；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.1.3 动物

清洁级SD大鼠50只，雄性，体质量0.18～0.22 kg，周龄6～8周，购自河北医科大学动物管理中心［实验动物许可证号SCXK（冀）2013-1-003］。标准条件饲养7 d，自由进食、饮水，适宜温度、湿度，人工黑暗和光照交替。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

分别于第29，43天以水合氯醛（0.5 mg/100 g）麻醉大鼠，然后向气管内注入LPS 200μg；每日上午将大鼠放于密封的1 m3烟室内，持续放入香烟烟雾，确保大鼠持续吸烟30 min，每日1次，每次15支，复制模型共用时56 d。建模成功标准：大鼠行动灵敏度及活动力均下降，进食量减少，毛发逐渐失去光泽，出现干涩枯黄，对外界刺激的敏感度下降，体质量明显减轻；病理学改变，开胸可见肺脏萎陷，肺脏体积明显增大，呈灰暗色；苏木精-伊红（HE）染色见典型肺气肿表现。

1.2.2 分组与给药

将50只大鼠随机分为空白对照组（等体积生理盐水）、模型组（等体积生理盐水）和辛伐他汀高、中、低剂量组（15，10，5 mg/kg），灌胃给药，每日1次，连续灌胃8周（除烟熏日外）。

1.2.3 免疫组化检测

腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mg/100 g）麻醉大鼠，开胸后心脏放血处死大鼠［10］。2叶右肺标本离体后用10%甲醛溶液固定24 h，脱水、石蜡包埋、切片。以HE染色，置显微镜下、选取6个视野观察，分析白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素22（IL-22）及RORγt表达水平。细胞胞浆内呈棕黄色颗粒即为阳性表达，颜色与表达呈正比，棕黄色颗粒越多即表达水平越强；细胞胞浆内未出现棕黄色颗粒即为阴性。

1.2.4 炎性因子表达水平检测

取上述切片，置显微镜下，以图像分析软件分析支气管黏膜上皮细胞阳性细胞百分数。选取内径＜2 mm的小气道，统计出气道间隔阳性细胞数，以每1 m3阳性细胞数表示。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对大鼠肺组织切片炎性因子表达的影响

结果见图1（因篇幅所限，仅选取辛伐他汀高剂量组作为代表）。

2.2 对大鼠气道间隔炎性因子阳性细胞数的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠气道间隔IL-17，IL-22，RORγt阳性细胞数显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀高、中剂量组大鼠气道间隔IL-17，IL-22，RORγt阳性细胞数显著减少（P＜0.05）。详见表1。

2.3 对大鼠支气管黏膜上皮组织炎性因子阳性细胞数的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠支气管黏膜上皮组织IL-17，IL-22，RORγt阳性细胞数显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀高、中剂量组大鼠支气管黏膜上皮组织IL-17，IL-22，RORγt阳性细胞数显著减少（P＜0.05）。详见表2。

3 讨论

COPD作为临床常见病及多发病，发病机制较复杂，且目前临床针对该疾病的基础研究及防治均无关键性突破［11-12］。COPD动物模型应具备慢性气道阻塞、小气道受阻增大及肺顺应性降低、与COPD相似的诱因、出现气道重塑及气道高反应性等特征［13-14］。目前，临床认为齿类动物可作为建模的最佳动物，其基因测序与人类极为相似；且其价格低廉，繁殖周期较快［15］。本研究中实施吸烟加气道内注射内毒素多因素诱导方案，香烟中含有甘油的尼古丁及氢氰酸等有毒物质可破坏气管纤毛上皮细胞，导致上皮细胞组织出现损伤或坏死，且气道及肺组织在烟雾作用下，通透性增加，易被蛋白酶攻击，损伤肺组织，最终诱发COPD［16-17］。

图1 免疫组化图（HE，×400）A.IL-17 B.IL-22 C.RORγtA1，B1，C1.Blank control group A2，B2，C2.Model group A3，B3，C3.Simvastatin high-dose groupFig.1 Immunohistochemical image（HE staining，×400）

表1 各组大鼠气道间隔炎性因子阳性细胞数比较（±s，%，n＝10）Tab.1 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in airway septum of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

表1 各组大鼠气道间隔炎性因子阳性细胞数比较（±s，%，n＝10）Tab.1 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in airway septum of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05。表2同。Note：Compared with those in the blank control group，a P＜0.05；compared with those in the model group，bP＜0.05；as well as Tab.2.

组别空白对照组模型组辛伐他汀 低剂量组中剂量组高剂量组IL-17 5.34±3.25 95.34±15.34a 85.64±13.24 76.35±11.28b 65.84±8.64b IL-22 8.64±3.15 64.98±9.68a 58.61±7.16 52.61±6.34b 38.64±4.02b RORγt 6.82±4.34 77.68±12.34a 71.64±10.36 62.13±8.24b 54.36±6.87b

表2 各组大鼠支气管黏膜上皮组织炎性因子阳性细胞数比较（±s，%，n＝10）Tab.2 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in the bronchial epithelial tissue of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

表2 各组大鼠支气管黏膜上皮组织炎性因子阳性细胞数比较（±s，%，n＝10）Tab.2 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in the bronchial epithelial tissue of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

组别空白对照组模型组辛伐他汀 低剂量组中剂量组高剂量组IL-17 8.57±4.72 78.68±10.98a 70.15±8.34 65.34±6.25b 58.64±4.21b IL-22 6.28±5.04 58.97±9.35a 51.31±8.25 46.35±7.02b 38.64±4.25b RORγt 7.58±3.57 79.46±11.24a 71.54±10.64 65.34±9.15b 52.31±7.21b

IL-17主要来源于CD4＋T淋巴的Th17细胞，通过特异性转录因子RORγt编码产生的效应因子，促进中性粒细胞及巨噬细胞的聚集及基质金属蛋白酶-9的分泌［18-19］。此外，IL-17还可促进支气管上皮细胞中气道黏液蛋白的产生，增强气道炎性反应，参与疾病发生与发展［20-22］。IL-22主要由Th17细胞及自然杀伤（NK）细胞产生，可诱导中性粒细胞的分泌，加重气道炎症程度，加快COPD进程［23］。他汀类药物是3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，主要在肝脏内合成，临床常用于血管疾病并发症预防及调脂治疗［24］。相关研究表明，他汀类药物可发挥抗炎、抗氧化及抑制黏附分子表达等作用［25］。本研究中，与模型组比较，辛伐他汀高、中剂量组大鼠气道间隔和支气管黏膜上皮组织IL-17，IL-22，RORγt阳性细胞数显著减少。辛伐他汀抑制气道及肺组织中性粒细胞渗出及炎性因子的释放，减轻全身炎性反应，破坏炎性细胞包膜上抑制蛋白及脂筏结构的异戊二烯化修饰，继而起到抗炎作用。本研究仍有一定局限性，如未针对不同剂量辛伐他汀用于COPD模型大鼠的不良反应进行研究，今后需进一步增加对不同剂量辛伐他汀治疗COPD安全性问题的分析。

综上所述，辛伐他汀可有效减弱COPD模型大鼠炎性因子的表达，减轻气道及肺部炎性反应。