氟尿嘧啶—大豆素拼合物的设计、合成及抗肿瘤活性研究

袁明,高梦蝶,王璞,刘长青,陶兆林

氟尿嘧啶—大豆素拼合物的设计、合成及抗肿瘤活性研究

袁明,高梦蝶,王璞,刘长青,陶兆林

(蚌埠医学院 公共基础学院,安徽 蚌埠, 233030)

设计合成氟尿嘧啶—大豆素拼合物, 并考察其对HepG2细胞增殖抑制活性。以氟尿嘧啶为先导物, 与氯乙酸反应制得5-氟脲嘧啶-1-基乙酸, 再与大豆素成酯反应制备氟尿嘧啶—大豆素拼合物, 采用MTT法测定氟尿嘧啶—大豆素拼合物HepG2细胞增殖抑制活性。结果表明: 氟尿嘧啶—大豆素拼合物抑制HepG2细胞增殖的IC50值为0.331 mM。氟尿嘧啶—大豆素拼合物在体外能明显抑制HepG2细胞增殖。

氟尿嘧啶; 大豆素; 拼合物; 细胞增殖; 抑制活性

我国中药资源丰富, 中药活性小分子也具有较好的抗肿瘤活性, 目前已经获得临床认可的有紫杉醇、长春碱以及长春新碱等小分子。已有文献报道, 中药活性小分子异黄酮类化合物具有显著的抗肿瘤活性[1–3]。中药小分子大豆素(Daidzein, 如图1)属异黄酮类化合物, 与具有抗肿瘤活性的染料木素同样主要来自于豆科植物, 如大豆、绿豆以及中药材葛根中。肿瘤坏死因子已被证实参与到肿瘤细胞的迁移和侵袭过程, 研究发现人乳腺癌细胞侵袭是由于基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)中两个亚型MMP-2、MMP-9活性增强, 而肿瘤坏死因子α通过Hh/Gli1 信号通路诱导MMP-9过表达和活性增强, 大豆素可显著抑制MMP-9过表达, 从而抑制肿瘤细胞的侵袭[4]。另有研究显示大豆苷元可诱导肿瘤细胞凋亡, 有研究发现3'-大豆苷元磺酸钠对人乳腺癌细胞MCF-7有促凋亡作用; Choi等研究得出大豆苷元促进人类乳腺癌细胞凋亡可能与ERα/C-erbB-2表达有关, 本研究发现大豆苷元可通过调节大鼠乳腺癌细胞因子的表达水平, 从而抑制乳腺肿瘤的细胞增值[5–7]。

图1 大豆素(Daidzein)结构

氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 如图2)是第一代抗代谢药, 于上世纪五十年代末问世。其对胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等具有较好的疗效, 在肿瘤治疗中起着至关重要的作用。此药临床应用虽然广泛, 但是存在较为严重的副作用, 如消化道反应、肝功能损害、骨髓抑制等[8–9]。近年来药物化学家对其进行了结构改造, 得到了替加氟[10](Ftorafur, 如图2)、卡培他滨[11](Capecitabine, 如图2)等氟尿嘧啶衍生物, 二者在治疗效率方面明显高于氟尿嘧啶, 且毒性明显低于氟尿嘧啶。

图2 氟尿嘧啶、替加氟和卡培他滨(5-Fluorouracil, Ftorafur, Capecitabine)结构

基于氟尿嘧啶与中药小分子异黄酮类化合物具有较强的抗肿瘤活性, 本文运用前药原理将的中药小分子大豆素与氟尿嘧啶衍生物进行成酯拼合(如图3), 得到氟尿嘧啶大豆素拼合物(DDS-F), 以期改善二者生物利用度、提高活性以及降低不良反应。

图3 氟尿嘧啶—大豆素拼合物(DDS-F)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian Unity INOVA-300 NMR谱仪用于测试1H和13C NMR, 其工作频率分为300 MHz和75 MHz((DMSO-为溶剂, TMS为内标); 细胞培养箱, 型号3111, Thermo Electron Corporation; 超净台, 型号SW-CJ-IF, 苏州净化设备有限公司; 酶标仪, 型号Varioskan Flash, Thermo Scientific。

大豆素(国药集团化学试剂有限公司, 纯度>98% ); 5-氟脲嘧啶(阿拉丁试剂上海有限公司, 纯度>99%, 合成原料); 氯乙酸(天津市光复精细化工研究所, 纯度>99.5%); 二氯亚砜(DMAP, 国药集团化学试剂有限公司, 纯度>99%); DMEM培养基, 批号: 1913063, Gibco公司; 胎牛血清, 批号: 18040302, 杭州四季青生物科技有限公司; 胰蛋白酶, 批号: 1C221C22, Sunshine公司; MTT, 批号: 331097/1594, Fluka公司; 5-氟尿嘧啶(5-fu, 用于活性测试), 批号: HR1170629, 上海思域化工科技有限公司。

1.2 合成部分

5-氟脲嘧啶-1-基乙酸(1)的合成分别取3 g(53.5 mmol)氢氧化钾, 30 mL水于100 mL 3口烧瓶中, 溶解后加入5.0 g (38.4 mmol)5-氟脲嘧啶, 100 ℃搅拌反应3 h后, 缓慢加入15 mL氯乙酸(3.6 g, 38 mmol) 水溶液, 60 ℃搅拌反应8 h。用浓盐酸调节反应液pH约为2, 冰浴保持4 h, 过滤得粗品, 将粗品溶于饱和碳酸氢钠溶液, 再用浓盐酸调节至pH约为2, 过滤干燥得到白色晶体(1)3.05 g, 产率42.3%[12]。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 13.23(s, 1 H), 11.92(s, 1 H) , 8.08(s, 1 H), 4.36(s, 2 H);13C-NMR(75 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 169.75, 158.08, 150.11, 141.27, 131.21, 49.08。

氟尿嘧啶-大豆素拼合物(DDS-F)的合成取化合物(1)2.0 g(10.6 mmol)溶解在新蒸的二氯亚砜(15 mL)中, 氮气氛围下70 ℃反应12 h后, 将过量二氯亚砜减压旋蒸除去, 残余物溶解在干燥的四氢呋喃(15 mL)中, 在冰浴条件下, 向溶解有1.3 g (5.3 mmol)大豆素、1 mL三乙胺的四氢呋喃溶液里缓慢滴加, 滴加完毕室温反应10 h, 将反应液蒸干, 将反应液用硅藻土过滤, 滤液旋干得到的粗品用石油醚/二氯甲烷重结晶, 得到白色固体(DDS-F)0.7 g, 收率22.3%[13]。1H-NMR( 400 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 12.01(s, 2 H), 8.62(s, 1 H) , 8.24(m, 3 H), 7.68(m, 3 H), 7.37(d,= 4Hz, 1 H), 7.26(d,= 8Hz, 2 H), 4.85(s, 2 H), 4.80(s, 2 H);13C-NMR(75 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 174.94, 167.40, 166.93, 163.23, 157.78, 156.57, 155.62, 154.29, 150.19, 130.87, 130.77, 130.71, 130.53, 127.87, 123.72, 122.47, 121.74, 121.62, 120.29, 111.71, 49.3。

1.3 体外抗HepG2细胞增殖活性研究

1.3.1 方法

生长良好的HepG2细胞, 无菌条件下移入细胞培养瓶中, 加入10% FBS的DMEM培养基置于通有5% CO2培养箱中37 ℃静置培养。取对数生长期的HepG2细胞, 消化成单细胞悬液, 10% FBS的DMEM培养基重悬, 接种于96孔板中(5×103cells/well)。细胞贴壁后, 分为正常组, 药物组(200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 μM), 培养48 h后, 弃上清, 每孔加入0.5 g/L MTT溶液200 μL共培养4 h后, 加入150 μL DMSO, 震荡10 min, 使结晶物充分溶解, 用酶标仪于490 nm处测定吸光度, 每次3复孔, 实验重复3次。

细胞存活率(%)=药物组(OD490)/正常组(OD490)´100%; 药物抑制率(%)=100%-细胞存活率(%)。

1.3.2 统计学处理

表1 5-fu对HepG2细胞活力的影响

注: *P < 0.05, **P < 0.01vs正常组。

2 结果与讨论

2.1 实验结果

本文通过两步法合成DDS-F, 并通过1H-NMR、13C-NMR对其结构进行表征; 同时应用MTT法测试DDS-F对HepG2 细胞增殖的抑制作用, 结果见表1和表2。

2.2 讨论

5-氟脲嘧啶-1-基乙酸合成, 待氟尿嘧啶完全溶解于后再加入氯乙酸, 加入后待反应液澄清后, 继续维持反应8 h, 确保反应收率最大。后处理时, 加浓盐酸须缓慢滴加, 以防产品损失在水溶液中。制备DDS-F, 注意5-氟尿嘧啶-1-基乙酰氯制备须在氮气氛围中进行。

表2 DDS-F对HepG2细胞活力的影响

注: *P < 0.05, **P < 0.01vs正常组。

3 结论

本文以氟尿嘧啶为先导物, 运用药物化学中拼合原理, 将具有抗肿瘤活性中药小分子大豆素与氟尿嘧啶进行拼接, 获得化合物DDS-F, 结构经1H-NMR、13C-NMR表征。MTT实验以氟尿嘧啶为阳性对照, 测得化合物DDS-F抑制HepG2细胞增殖的IC50值为0.331 mM, 数据显示其在体外能明显抑制HepG2细胞增殖。

有文献报道, 大豆素对乳腺癌和结肠癌细胞细胞增殖有明显抑制作用, 后续将对这两种细胞系的抑制作用做研究。以及考察大豆素结构中不同位置羟基成酯后的体外增殖抑制活性研究。

[1] Kohen F, Gayer B, Kulik T, et al. Synthesis and evaluation of the antiproliferative activities of derivatives of carboxyalkyl isoflavones linked to N-t-Boc-hexylenediamine [J]. J. Med. Chem. 2007, 50, 6 405–6 410.

[2] Yang YY, Tsai TH. Enterohepatic circulation and pharmacokinetics of genistin and genistein in rats [J]. ACS Omega,2019, 4(19): 18 428–18 433.

[3] Guo JM, Yan G, Zhang MM, et al. Anti-inflammatory and antiproliferative prenylated isoflavone derivatives from the fruits of ficus carica [J]. J. Agric. Food Chem.,2019, 67(17): 4 817–4 823.

[4] Bao C, Namgung H, Lee J, et al. Daidzein suppresses tumor necrosis factor-α induced migration and invasion by inhibiting Hedgehog/Gli1 signaling in human breast cancer cells [J]. J. Agric. Food Chem., 2014, 62(17): 3 759–3 767.

[5] 康欣梅, 王慧, 王丽, 等. 大豆苷元对乳腺癌生长和血管生成的影响[J]. 癌变·畸变·突变, 2015, 27(1): 16–20.

[6] Jiang Q, Payton-Stewart F, Elliott S, et al. Effects of 7-O substitutions on estrogenic and anti-estrogenic activities of daidzein analogues in MCF-7 breast cancer cells [J]. J. Med. Chem., 2010, 53, 6 153–6 163.

[7] Leclercqa G, Jacquot Y. Interactions of isoflavones and other plant derived estrogens with estrogen receptors for prevention and treatment of breast cancer-Considerations concerning related efficacy and safety [J]. J. Steroid. Biochem. 2014, 139, 237–244.

[8] Kline CLB, Schiccitano A, Zhu JJ, et al. Personalized dosing via pharmacokinetic monitoring of 5-fluorouracil might reduce toxicity in early- or late-stage colorectal cancer patients treated with infusional 5–fluorouracil-based chemotherapy regimens [J]. Clin Color Cancer, 2013, 13(2): 119–126.

[9] 王卫东. 5-氟尿嘧啶类抗癌药物的分子修饰研究进展[J]. 药学进展, 2008, 32(12): 536–542.

[10] 李勇, 陈思现, 黄瑞文, 等. 草酸铂及亚叶酸钙分别联合替加氟或氟尿嘧啶治疗晚期胃癌疗效比较[J]. 中国现代医药杂志, 2006, 8(11): 50–52.

[11] 姜振宇, 荆蕾, 许颖, 等. 奥沙利铂联合氟尿嘧啶或卡培他滨治疗老年晚期结肠癌的效果评价[J]. 吉林大学学报(医学版), 2009, 35(6): 1 151–1 153.

[12] Sauraj, Kumar SU, Gopinath P, et al. Synthesis and bio-evaluation of xylan-5-fluorouracil-1-acetic acid conjugates as prodrugs for colon cancer treatment [J]. Carbohydr. Polym. 2017, 157, 1 442–1 450.

[13] Giret S, Thron C, Gallud A, et al. A designed 5-fluorouracil-based bridged silsesquioxane as an autonomous acid-triggered drug-delivery system [J]. Chem. Eur. J., 2013, 19, 12 806–12 814.

Design, synthesis and antitumor activity of Fluorouracil-Daidzein conjugates

Yuan Ming, Gao Mengdie, Wang Pu, Liu Changqing, Tao Zhaolin

(School of Fundamental Sciences, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China)

5-Fluorouracil-Daidzein conjugates is designed and synthesized, and its inhibitory activity on HepG2 cell proliferation is investigated. 5-fluorouracil-1-glycolic acid is prepared by reaction of fluorouracil, which is a lead compound, with chloroacetic acid, and then the 5-Fluorouracil-Daidzein conjugate is synthesized by ester reaction with daidzein. The proliferation inhibition activity of 5-Fluorouracil-Daidzein conjugates on HepG2 cells is determined by MTT method. 5-Fluorouracil-Daidzein conjugates inhibits HepG2 cell proliferation with an IC50of 0.331 mM.5-Fluorouracil-Daidzein conjugates can significantly inhibit HepG2 cell proliferation in vitro.

5-fluorouracil; daidzein; conjugates; cell proliferation; inhibitory activity

10.3969/j.issn.1672–6146.2021.01.012

R 914.2

A

1672–6146(2021)01–0058–03

陶兆林, 1158374617@qq.com。

2020–4–28

安徽省教育厅重点项目(KJ2018A0222); 蚌埠医学院自然科学基金项目(BYKY1751)。

(责任编校: 郭冬生)