UPLC-MS/MS法对5个产地黑果枸杞指标成分检测研究①

张祝莉，李梅英，姜 侃，马锦缘，车晓榕，郭晔红

（1甘肃农业大学农学院;甘肃省中药材研究所;甘肃省干旱生境作物学重点实验室，兰州730070；2 国家林草局甘肃濒危动物保护中心，甘肃 武威733000）

黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)为茄科枸杞属(LyciumL.)落叶多棘刺灌木，黑果枸杞的干燥成熟果实[1]，主产于甘肃、新疆、青海等荒漠区[2-3]。具兴奋大脑神经，降低胆固醇、增强免疫功能、防止癌症和抗氧化作用的功效，临床上多用于治疗心脏病、月经不调等症状[4]。黑果枸杞主要含有多酚类、原花青素类、花青素、黄酮、多糖等多种活性成分[5-6]。多酚类化合物具有抗动脉硬化、降血脂、防止衰老和抗肿瘤等作用[7-9]。黑果枸杞中的黄酮类成分具有降低胆固醇、抗炎、降血糖等作用，芦丁则是其代表性成分[10-11]。原花青素类具有清除自由基和抗氧化等活性，由儿茶素和表儿茶素缩合而成[11-15]。花色苷具有抗氧化、抗突变、抗癌变、抗高血糖等活性，研究表明花色苷可减轻视疲劳、抑制流感病毒和苞疹病毒的活性[16-18]。本研究采用超高效液相色谱的方法测黑果枸杞中花青素、原花青素、多酚、黄酮中含量，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器AL104 型万分之一天平(上海力辰邦西仪器科技有限公司)；超纯水器(四川优普超纯科技有限公司)；Agilent 1290-6460 型超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(美国安捷伦公司)；H-2050R型台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；新FiveGo便携式pH计F2-Standard(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；PS-30 型超声波清洗机(深圳德康科技有限公司)。

1.2 试药没食子酸标准品(成都普菲德生物技术有限公司，批号18032703)，芦丁标准品(成都普菲德生物技术有限公司，批号18122902)，儿茶素标准品(成都普菲德生物技术有限公司，批号18061201，纯度≥98%)，飞燕草色素标准品(上海源叶生物有限公司，批号P23M10S84023，纯度≥97%)；甲醇(色谱纯)；无水乙醇(色谱纯)。黑果枸杞药材2019 年7 月分别采集于甘肃武威、甘肃张掖、甘肃民勤、新疆和田和青海海西州，经甘肃农业大学郭晔红副教授鉴定为茄科枸杞属(LyciumL.)落叶多棘刺灌木黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)的干燥成熟果实黑果枸杞果实。经55℃鼓风烘干后粉碎过40目筛，备用。

2.1 供试品溶液的制备飞燕草色素供试品溶液的制备：称取黑果枸杞粉末1.000 0 g，依次加入Ph=2.5的75%乙醇60 mL，称重，超声萃取15 min 后，称量补重，取上层清液，过滤(0.22 μm 有机滤膜)，即得供试品溶液，提取过程中锡箔纸包裹离心管中避光提取，备用。

没食子酸、儿茶素、芦丁供试品溶液的制备：称取黑果枸杞粉末2.000 0 g，依次加入5 mL 甲醇和5 mL水，称重，超声萃取40 min后，称量补重，取萃取液上层清液6 000 r/min 离心10 min，过滤(0.22 μm 有机滤膜)，制得供试品溶液，备用。

2.2 对照品溶液的制备分别称取没食子酸标准品2.0 mg、儿茶素标准品2.0 mg、芦丁标准品2.0 mg，分别置于10.0 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，既得浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。避光备用。称取飞燕草色素1.0 mg 置于5 mL 容量瓶中，用5%盐酸-甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.20 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.3 色谱条件及质谱条件色谱柱条件：Agilent Eclipse Plus-C18(150 mm×2.1 mm, 1.8-Micron)；流动相0.1%甲酸(A)-100%甲醇(B)；柱温：25℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL，各成分梯度洗脱程序见表1、2。质谱条件：干燥气及雾化气均为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为11 L/min，雾化气压力为2.15 KPa，电喷雾离子源(ESI)，喷雾电压-4.0 kV，选择正负离子监测模式，多重反应扫描模式。没食子酸在负离子(ESI-)模式下选取母离子(m/·z)为169.01，碎裂电压(CE/EV)为13 和25，碎片离子(m/z)为125 的定量离子和79，保留时间为1.18 min。儿茶素在正离子(ESI+)模式下选取母离子(m/z)为291.09，碎裂电压(CE/EV)为13和9，碎片离子(m/z)为139的定量离子和123，保留时间为2.85 min。芦丁在正离子(ESI+)模式下选取母离子(m/z)为611.16，碎裂电压(CE/EV)为17和45，碎片离子(m/z)为303 的定量离子和85.1，保留时间为3.02 min。飞燕草色素在正离子(ESI+)模式下选取母离子(m/z)为339.03，碎裂电压(CE/EV)为17 和37，碎片离子(m/z)为283.1 的定量离子和121.1，保留时间为4.03 min。

2 方法与结果

表1 没食子酸、儿茶素、芦丁梯度洗脱程序

表2 飞燕草色素梯度洗脱程序

2.4 回归方程的建立取“2.2”项下没食子酸对照品进行稀释，配置成1、2、5、10、50、100 μg/mL 标准待测溶液。按“2.3”项下的色谱条件进行测定，以对照品质量浓度(X)为横坐标，质谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归分析，计算没食子酸的回归方程为Y=8.167 1X-12.181，r=0.998。结果 表明没食子酸浓度在1～100 μg/mL 范围内，线性范围内线性关系良好。取“2.2”项儿茶素对照品进行稀释，配制成0.5、1、2、5、10、50 μg/mL 的标准待测溶液。按“2.3”项下的色谱条件进行测定，以对照品质量浓度(X)为横坐标，质谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归分析，计算儿茶素的回归方程为Y=67.117X-36.417，r=0.999。结果 表明儿茶素浓度在0.5～50.0 μg/mL 范围内线性关系良好。取“2.2”项芦丁的对照品进行稀释，配制成0.1、0.5、1、2、5、10、50、100 μg/mL 的标准待测溶液。按“2.3”项下的色谱条件进行测定，以对照品质量浓度(X)为横坐标，质谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归分析，计算芦丁的回归方程为Y=50.805X+11.928，r=0.999 结果表明芦丁浓度在0.1～100.0 μg/mL 范围内线性关系良好。取“2.2”飞燕草色素的对照品进行稀释，配制成20、60、80、100、150 μg/mL 的标准待测溶液。按“2.3”项下的花青素色谱条件进行测定，以对照品质量浓度(X)为横坐标，质谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归分析，计算飞燕草色素的回归方程Y=863.8X+114.9，r=0.997 结果表明飞燕草色素浓度在20～150 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验取新疆和田的样品，分别按“2.1”项下方法分别制备2 种供试品溶液，按“2.3”项下条件测定相应成分，连续进样6次，计算各成分峰面积，结果没食子酸、儿茶素、芦丁、飞燕草色素的峰面积RSD 分别为2.1%、2.4%、1.7%、2.7%（n=6），表明方法精密度良好。

2.6 稳定性实验取新疆和田的样品，按照“2.1”项下分别方法制备供试品溶液，按照“2.3”下测定，分别于0、2、4、6、10、15、24h进样，测定没食子酸、儿茶素、芦丁的峰面积。结果 没食子酸、儿茶素、芦丁的RSD分别为2.2%、2.1%、0.99%（n=7），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。取采自新疆和田的样品，按照“2.1”项下方分别法制备供试品溶液，按照“2.3”下测定，分别于0、20、40、50、60、75 min 进样，测定飞燕草色素的峰面积。结果 飞燕草色素的RSD 为1.8%（n=6）。表明供试品溶液在75 min内稳定性良好。

2.7 重复性试验取新疆和田的样品，按照“2.1”项下方法分别制备供试品溶液6 份，按照“2.3”测定其峰面积，计算没食子酸、儿茶素、芦丁、飞燕草色素含量并计算RSD 值分别为2.02%、2.18%、2.08%、2.73%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验取新疆和田样品粉末1.000 0g，按“2.1”项下方法分别平行制备2 份供试品溶液，一份加入等体积的提取液，另一份加入等体积已知质量浓度的对照品混合溶液。分别进样，测定峰面积，计算各成分加样回收率。没食子酸、儿茶素、芦丁和飞燕草色素平均回收率分别为99.80%、99.50%、98.90%、98.50%。RSD 分别为1.96%、1.38%、1.74%，1.50%，表明方法准确度良好。

2.9 含量测定取不同产地的供试品，粉碎机粉碎后过40 目筛，分别依照“2.1”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.3”项下条件测定，分别计算黑果枸杞中没食子酸、儿茶素、芦丁、花青素的含量。结果 为新疆和田的黑果枸杞中没食子酸含量为0.320 mg/g，儿茶素为0.017 mg/g，芦丁为14.769 mg/g，飞燕草色素为3.793 mg/g；青海海西州的黑果枸杞中没食子酸含量为0.098 mg/g，儿茶素为0.032 mg/g，芦丁为32.089 mg/g，飞燕草色素为0.794 mg/g；甘肃民勤的黑果枸杞中没食子酸含量为0.086 mg/g，儿茶素为0.017 mg/g，芦丁为7.532 mg/g，飞燕草色素为1.467 mg/g；甘肃张掖的黑果枸杞中没食子酸含量为0.280 mg/g，儿茶素为0.014 mg/g，芦丁为7.532 mg/g，飞燕草色素为1.152 mg/g；甘肃武威的黑果枸杞中没食子酸含量为0.303 mg/g，儿茶素为0.023 mg/g，芦丁为20.294 mg/g，飞燕草色素为5.198 mg/g。

3 讨论

超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用法通过对目标化学成分施加电压将其离子化后进行定性分析，可精准分析化合物，质谱条件的优化对单一标准品通过optimizer 软件进行自动质谱扫描后确定各分子离子，选取定性定量离子。不同梯度洗脱和进样量对其进行色谱条件优化。本研究首次建立了以超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用法对黑果枸杞干果中4 种成分的定量测定。在制备供试品溶液的过程中，分别尝试其他不同梯度的乙醇和甲醇进行提取，但结果并不理想，试验表明，黑果枸杞在50%甲醇的提取条件下能够同时对没食子酸、儿茶素和芦丁进行有效的分离提取。在制备花青素供试品溶液中，比较1%、5%、50%、75%的盐酸乙醇作为提取剂，经过比较后得出黑果枸杞在Ph=2.5 的75%乙醇中提取效果最好。在提取黑果枸杞中花青素时应注意提取时间与检测时间不宜过长。

本研究建立UPLC-MS/MS 法检测产地黑果枸杞中没食子酸、儿茶素、芦丁、飞燕草色素4种成分定性定量检测分析。该方法简单，灵敏度高，定性结果可靠、分析测试时间短，精密度、重复性、回收率均较好，适用于黑果枸杞干果指标性成分的准确测定和品质评价。为濒危药用黑果枸杞资源的追踪溯源和原产地认证提供了技术支撑。