miR-24-3p在肺结核病患者血清中的表达及其临床意义

侯新月，周慧芳，孟存仁

（1新疆维吾尔自治区第二济困医院检验科，乌鲁木齐830026；2新疆喀什地区第一人民医院检验科，新疆喀什844000；3新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，乌鲁木齐830054）

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病，通常以肺结核病居多，全球每年大约有1 000 万例以上的新增感染，其死亡病例更是高达近140 万例，是全世界面临的严重的公共卫生问题[1]。我国活动性肺结核人数超过200万，每年结核病死亡人数大约12万[2]，结核杆菌感染后主要通过侵犯巨噬细胞并引起相关细胞因子的释放，进而引起T 淋巴细胞释放γ 干扰素，多个细胞因子参与了机体的天然免疫和适应性免疫反应，引起了结核病的发病和活动性改变。然而结核病的致病机制并不完全清楚。近年来以微小RNA（microRNA,miRNA）为代表的非编码RNA 在结核杆菌感染及免疫反应中调控机制的研究较多。本研究选取了前期在芯片试验中筛选出的差异表达的miR-24-3p，进一步验证其在肺结核病组、其他肺部疾病组和健康对照组中的表达差异，以及活动性和非活动性肺结核之间的差异，并探讨其对于结核病诊断的意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象2017 年8 月—2018 年12 月间在新疆喀什地区第一人民医院就诊的肺结核患者为病例组（肺结核病组），肺结核病组又分为活动性肺结核组和非活动性肺结核组。以同期在该院就诊的其他肺部疾病患者为疾病对照组（其他肺部疾病组），另外以同期在该院进行健康检查的人员为健康对照组。研究对象的纳入标准：所有肺结核患者诊断符合中华人民共和国卫生行业标准（WS 288-2017）《肺结核诊断》[3]，其中活动性肺结核符合《结核病分类》（WS196-2017）[4]，即具有结核病相关的临床症状和体征，结核分枝杆菌病原学、病理学、影像学等检查有活动性结核的证据。肺结核病组中除外活动性肺结核即为非活动性肺结核,要求无其他肺部疾病，无肝、肾功能损害，无其他慢性消耗性疾病和恶性肿瘤，年龄在18 岁以上。其他肺部疾病均符合相应的诊断标准。肺结核病组、其他肺部疾病组和健康对照组的年龄和性别构成无统计学差异。排除标准：孕妇，有手术史，使用过抗结核药物，年龄小于18岁，资料不全者除外。所有研究对象均经过知情同意并经伦理委员会批准（伦理审批号:20140212-112）。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 清晨空腹采集静脉血3 mL，室温放置1 h 后，以3 000 rpm 离心10 min，收集上层血清于1.5 mL离心管中，放置于－70℃冰箱保存。

1.2.2 总RNA提取 使用Qiagen miRNeasy Mini kit试剂盒（德国Qiagen 公司）进行血清中的总RNA 提取，按说明书操作，提取后的总RNA 用NanoDrop ND -1000 紫外分光光度计(Thermo Scientific)测定核酸纯度和浓度，以A260/A280在1.8～2.0 之间为RNA 纯度较高，浓度达到10 ng/μL，总RNA 量达到500 ng 为符合要求。

1.2.3 逆转录和miR-24-3p 的qRT-PCR 检测 采用PrimeScript ™RT 试剂盒（大连Takara 公司产品）进行RNA 反转录，获得cDNA，按说明书操作，反应程序为：37℃15 min（反转录反应），85℃5 sec（反转录酶的失活反应），4℃保存。qRT-PCR 检测采用SYBR Green qPCR 分析法，试剂为SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），大连Takara 公司产品，反应体积25 μL，反应步骤为：95℃预变性30 s，95℃5 s，60℃30～34 s，40个循环，扩增结束后，建立融解曲线以观察扩增特异性，程序为95℃，15 s；60℃，1 min，95℃，15 s。以U6作为内参对照。miR-24-3p 反转录引物序列为：5"-CTGGGTATCCATCGCTGGGTCCCAGGTAATCCCACAGTACGACTGGGGT-3", qRT-PCR 扩增引物序列为：上游引物：5"-ACCGATACTTCTCGTCCTTGCC-3", 下 游 引 物：5"-CTGTTCCTGCTGAACTGAGGCA-3"；U6 茎环引物：5"- GTCGTATCCAGTGCAGGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAAT-3"上游引物：5"-CAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3"，下 游 引 物：5"-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3"[5]。

1.2.4 数据处理 以U6为内参对每个样本的Ct值进行归一化处理，即ΔCt=样本Ct 值－内参基因（U6）Ct值，以2-ΔCt作为miR-24-3p 相对表达量，进行病例组和各对照组间的比较。

1.3 统计学处理采用Graphpad Prism 8.0统计软件进行数据处理。计量资料数据以±s表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数的两两比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义，采用该统计软件绘制肺结核病组、其他肺部疾病组和健康对照组及活动性与非活动性肺结核间判别的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线），并计算曲线下面积（area under curve，AUC），评价诊断效能。

2 结果

2.1 研究对象的一般情况共收集肺结核病患者50例，其中男性31 例，女性19 例，平均年龄（48 ± 7.5）岁。活动性肺结核30 例，非活动性活动性肺结核20例。其他肺部疾病患者30 例，包括支气管肺炎11例、肺纤维化5例、肺癌6例、慢性阻塞性肺疾病8例。健康对照组30 例。其他肺部疾病患者与健康对照组、肺结核病组患者在年龄分布和性别构成上无统计学差异（P＞0.05)。

2.2 肺结核病组、其他肺部疾病组及健康对照组血清miR-24-3p 相对表达量比较肺结核病组、其他肺部疾病组和健康对照组血清中miR-24-3p 的表达量分别为0.260 2±0.142 6、0.365 4±0.111 1 和0.611 7±0.185 6；肺结核病组的表达量低于其他肺部疾病组和健康对照组（q值分别为4.384 和14.64，P均＜0.01）；其他肺部疾病组表达量低于健康对照组（q值为9.175，P＜0.01）。

2.3 活动性肺结核与非活动性肺结核组miR-24-3p 的表达量比较活动性肺结核组和非活动性肺结核组miR-24-3p 的表达量分别为0.213 3±0.026 0 和0.330 4±0.103 0，活动性肺结核组明显低于非活动性肺结核组（t=3.16，P＜0.01）。

2.4 miR-24-3p 对肺结核病诊断及活动性鉴别的价值分析ROC 曲线分析表明miR-24-3p 对于区分肺结核病与健康人的灵敏度和特异度分别为86.0%和90.0%，当诊断阈值为0.403 4 时AUC 最大，为0.926 7，95%CI[0.863 7-0.989 6]，P＜0.000 1，表明有较好的诊断价值；对于区分肺结核病组和其他肺部疾病组的灵敏度和特异度分别为64.0%和83.0%，AUC 为0.726 0，95%CI[0.616 6-0.835 4]，P＜0.001；活动性肺结核和非活动性肺结核鉴别的灵敏度和特异度分别为53.0%和100.0%，AUC 为0.772 5，95%CI[0.642 5-0.902 5]，P＜0.01。见图1。

图1 miR-24-3p用于肺结核病诊断及活动性鉴别的ROC曲线

3 讨论

流行病学资料表明，全球有约1/3 左右的人曾经感染过MTB，但真正发病成为活动性结核的人不到10%,表明机体的免疫系统在防止结核病发病中起到了重要作用[6]。MTB 感染后首先被巨噬细胞吞噬，在溶酶体酶的作用下，通过产生活性氧诱导巨噬细胞凋亡，或通过分泌细胞因子激活T 淋巴细胞杀死MTB[7]。也可以由于机体的适应性免疫反应，使MTB在巨噬细胞内存活下来。众多研究表明miRNA 参与了MTB感染后机体的免疫调控。

miRNA 是一种小分子非编码RNA，只有20～24个碱基对左右，却广泛参与了多个生物学过程，包括细胞分化、凋亡，肿瘤的发生发展以及炎症过程等[8]。本研究小组在前期的研究中利用表达谱芯片筛选出了86 个在结核病中差异表达的miRNA，其中43 个高表达，43 个低表达[9]。本次研究中用qRT-PCR 对其中的miR-24-3p 在肺结核病组、其他肺部疾病组和健康人中进行了验证，表明其相对于其他肺部疾病和健康人低表达，差异有统计学意义，miR-24-3p 在活动性肺结核组中的表达也明显低于非活动性肺结核组。miR-24-3p在一些恶性肿瘤中低表达，包括乳腺癌[9]、肺癌[10]、膀胱癌[11]、胰腺癌等[12]。而在结核病患者中表达情况的研究较少，通过分析上述研究中的结果，发现miR-24-3p 的主要作用是在转录后水平上抑制相应蛋白质的翻译，进而抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡，miR-24-3p 的下调有利于肿瘤增殖和扩散。基于此，认为miR-24-3p 在结核病致病中的作用与此相似，下调的miR-24-3p 通过对靶基因的调控，抑制了巨噬细胞的凋亡，有利于MTB 的存活和导致活动性肺结核。此外，miR-24-3p可以在转录后水平上抑制SP1基因的翻译，限制SPI蛋白水平，进而影响炎性介质的释放[13]，这也可能是其在MTB 感染后免疫反应中的作用机制。

结核病的早期诊断中分子诊断发挥了重要的作用，克服了细菌培养时间长和涂片阳性率低的缺点，除了病原学分子诊断外，近年来不少研究报道了miRNA 在结核病诊断中具有重要价值，曹帅丽等[14]将miR-155-5p 作为分子标志物，对肺结核诊断的灵敏度为80%，特异性为90%，ROC 曲线下面积AUC 为0.905，表明有一定诊断价值，miR-24-3p 作为标志物诊断结核病尚无研究报道，本研究中miR-24-3p 用于区分肺结核和健康对照组的ROC 曲线下面积AUC为0.926 7，灵敏度为86%，特异性为90%，高于Meng等[15]报道的miR-24-3p 用于乙肝病毒相关肝癌的诊断，表明了较好的诊断价值。miR-24-3p在肺结核和其他肺部疾病的鉴别上也有一定的意义，灵敏度为64%，特异度为83%，AUC 为0.726 0。活动性肺结核与非活动性的鉴别通常主要靠病原学检查，灵敏度较低，本试验中miR-24-3p 用于区分二者的特异性可以达到100%，预示着较好的鉴别价值。此外，本研究中其他肺部疾病组和健康人之间miR-24-3p 的表达也存在差异，说明对于结核病来讲，miR-24-3p 可能并不是一个非常特异的标志物，尚需更多的样本、更严格的纳入排除标准进行验证。

综上所述，miR-24-3p在肺结核病患者血清中表达低于其他肺部疾病和健康人，miR-24-3p可能通过调控靶基因影响巨噬细胞凋亡和细胞因子释放等参与了MTB 感染后的免疫过程，miR-24-3p 对结核病诊断具有一定意义，有待进一步研究。