氟对成骨细胞Saos-2 DNA甲基化的影响

秦 纹，马 红，张美林，陈 龙，张美玉，钟近洁

(1新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，乌鲁木齐830054；2乌鲁木齐市血液中心830011；3新疆医科大学基础医学院机能中心，乌鲁木齐830054；4浙江大学紫金港校区医学院，杭州310000)

地方性氟中毒流行于中国的许多省区，新疆也是流行的主要地区之一。其在该地区主要表现为饮水型氟中毒。发生此病的最主要原因是水中的氟离子含量超标并长期饮用这种氟超标的水，研究证实:人体每天摄入的氟在4mg 以上就可引起慢性氟中毒[1]。氟主要作用于人体的骨组织，引起骨发损伤，它的基本病征是氟斑牙（儿童）和氟骨症（成人）[2]。虽然已清楚氟中毒的发病原因，对发病机制的研究有了一些进展，但它的发病机制的复杂性远远超出我们的想象，至今尚不完全清楚。近年来表观遗传学成为各个学科领域的研究热点，DNA 甲基化的研究成为表观遗传学和表观基因组学中的重中之重；DNA 甲基化是在酶（DNA 甲基化转移酶）的作用下，在基因组CpG 二核苷酸的胞嘧啶5"碳位共价键结合一个甲基基团[3-4]。体内外研究证实:少量的氟对机体是有利的，能促进成骨细胞的增殖，但过量的氟则会起到反作用，对机体有害，因为过量的氟会使成骨细胞的增殖受到不同程度的抑制[5]。除此之外，研究表明氟能进一步影响细胞DNA 使其甲基化的状态发生变化，进一步导致表观遗传模式变化[6]。本研究在建立成骨细胞氟中毒模型的基础上检测不同剂量的氟对成骨细胞甲基化程度的影响以及骨基因mRNA 转录表达的情况。从表观遗传学的新视角入手来深入研究氟中毒的致病机制，为氟中毒的早期诊断和治疗提供新思路、新方法。

1 材料与方法

1.1 材料Saos-2细胞株购自中科院上海细胞库；Mc-Coy"s5A Medium 培养基购自美国Gibco；胰蛋白酶购自美国Gibco；MTT 细胞增殖试剂盒购自北京索宝来生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自北京索宝来生物科技有限公司；流式细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；DNA提取试剂盒、反转录试剂盒和实时定量PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司公司；酶标仪购自美国Thermo 公司；实时定量PCR 仪7500购自美国ABI 公司；细胞培养箱购自美国Thermo。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 复苏细胞Saos-2，接种于25cm2的培养瓶中放置37 ℃、5%的CO2培养箱中培养，2 d换1次培养基。

1.2.2 MTT 实验 取在生长对数期的成骨细胞Saos-2，用0.25%胰蛋白酶消化2 min 后终止消化（含有血清的培养基），1000 rpm 离心5 min，弃上清，加入完全培养基轻轻吹打至单个细胞悬液，每孔2×104/个，接种到96 孔细胞培养板中，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h。每孔加入0、2.5、5、10、20、40、80 mgF－/L的氟化钠的培养基200 μL，每孔设置6 个复孔，37 ℃，5%CO2培养箱中培养24、48、72、96 h，避光加入10μL 提前配置好的MTT 溶液，37 ℃，5%CO2培养箱孵育3～4 h 后再加150 μL DMSO，在酶标仪490 nm波长处测定各组的吸光度并记录吸光度的OD值。

1.2.3 流式细胞仪法检测不同浓度氟对成骨细胞Saos-2凋亡的影响 细胞培养同上，将细胞每孔以5×104/孔接种于6 孔细胞培养板上，培养条件与染氟同上。用胰酶消化染氟细胞1 000 r/min 离心5 min，再用PBS 洗2 遍。按细胞凋亡试剂盒说明书进行操作，最后在流式细胞仪上进行检测并记录实验数据。(根据MTT 实验结果选取促进增殖和抑制增殖较明显的72h进行检测)

1.2.4 染氟成骨细胞DNA 甲基化的检测 按照DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA。用紫外线分光光度仪测定光密度(OD)值，1.6～1.8 为合格DNA 序列。将合格的DNA 序列用亚硫酸盐处理后的进行DNA 甲基化芯片杂交（Illumina 的850K 芯片），按照Illumina的标准操作流程进行。

1.2.5 RT－PCR 检测成骨细胞相关的基因的表达提取样本总RNA：各染氟组细胞中加入1 mL Trizol提取总RNA，RNA 样品的纯度、浓度经鉴定合格后冻存于-80℃备用。逆转录合成cDNA：用逆转录试剂盒转录成cDNA 待用（试验操作按照产品说明书进行）。引物设计与合成：在GenBank数据库中查询成骨细胞特异性转录因子（Osterix、Runx2），DNA 甲基转移酶1（DNMT1）mRNA 序列，由上海生工生物技术有限公司设计并完成引物序列的合成。Osterix（87 bp）的引物序列为Forward primer：5"ACTCACACCCGGGAGAAGAA 3"；Reverse primer：5"GGTGCGCTGGTGTTTGCT 3"。Runx2 (81bp)的引物序列为Forward primer：5"TGCACTATCCAGCCACCTTTACT 3"；Reverse primer：5"TAGTGAGTGGTGGCGGACATAC 3"。 DNMT1(120bp)Forward primer：5"CCGGCCCCGGTTCTT 3"；Reverse primer：5"ACGCCGAAGGTGCACTGA 3"。RT-PCR：使用北京全式金生物技术有限公司扩增试剂盒在ABI7500扩增仪上进行，试验操作按照产品说明书进行，扩增体系如下：25 μL 2×superReal 荧光定量预混试剂增强版;1 μL 上游引物(10 μmol/L)；1 μL下游引物(10 μmol/L)；2 μLcDNA 模板（样品cDNA 稀释10 倍）；加入去RNA 酶的双蒸水至50 μL。每个样品重复检测3 次。在60～95℃进行熔解曲线分析。ABI 7500 型实时荧光定量PCR 仪采集待测基因的扩增循环数，计算其△△Ct 值及2-△△Ct 。计算Osterix 、RANKL、DNMT1 基因的相对表达水平后染氟组与对照组结果进行比较。

1.3 统计学分析所有实验数据采用SPSS18.0 软件进行分析，结果用(-x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量NaF对成骨细胞增殖的影响染氟72、96 h 时，5 mg/L 的NaF 对成骨细胞Saos-2 增殖活力较0 mg/L组有明显的促进作用(P＜0.05)；≥72 h时，20 mg/L 的NaF 对成骨细胞Saos-2 增殖活力较0 mg/L 组有明显的抑制作用(P＜0.05)，且随着NaF 剂量的增大和时间的延长对细胞增殖活力的抑制逐渐增强，见表1。

表1 不同剂量NaF对成骨细胞Saos-2增殖活力的影响(±s)

表1 不同剂量NaF对成骨细胞Saos-2增殖活力的影响(±s)

注：与剂量为0 mg/L 的NaF 相比，*P＜0.05(活力增加程度)；与剂量为0 mg/L的NaF相比，#P＜0.05(活力减少程度)。

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不同剂量NaF 对Saos-2 作用72 h 后对细胞增殖的影响，其中2.5、5 mg/L 的NaF 对成骨细胞Saos-2 增殖活力较0 mg/L 组有明显的促进作用(P＜0.05)；≥20 mg/L 的NaF 较0 mg/L 组明显抑制成骨的增殖作用,见图1。

2.2 不同剂量NaF 对成骨细胞DNA 甲基化的影响不同剂量的NaF 对Saos-2 作用后对DNA 甲基化程度有不同的影响，其中5 mg/L 的NaF 作用后DNA 甲基化程度较0 mg/L 组明显的降低(P＜0.05)；≥20 mg/L 的NaF作用后DNA甲基化程度较0 mg/L组明显的增高,见表2。

图1 流式细胞仪检测不同剂量NaF对成骨细胞Saos-2作用72h后增殖的影响

表2 不同剂量NaF对成骨细胞Saos-2 DNA甲基化的的影响(±s)

表2 不同剂量NaF对成骨细胞Saos-2 DNA甲基化的的影响(±s)

注：与剂量为0mg/L 的NaF 相比，*P＜0.05(甲基化程度降低)；与剂量为0 mg/L 的NaF 相比，#P＜0.05(甲基化程度增高)；β≥0.6为完全甲基化的，β≤0.2的为完全未甲基化的，β 值在0.2＜～＜0.6为部分甲基化的。

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2.3 不同剂量NaF 对成骨细胞DNMT1、Runx2、Osterix 基因表达的影响5 mg/L 的NaF 作用成骨细胞Saos-2 后DNMT1 的表达量较0mg/L 组明显降低，Runx2、Osterix 的表达量较0mg/L 组明显的增高(P＜0.05)；≥20mg/L 的NaF 作 用 成 骨 细 胞Saos-2 后DNMT1 的表达量较0mg/L 组明显升高，Runx2、Osterix 的表达量较0mg/L组明显的降低(P＜0.05)，见图2。

3 讨论

氟在外界环境中分布广泛，但在外界环境中的分布的特点不同，因此造成流行区域不同。在流行区域氟往往是过量的，使得在此区域的人长期摄入过量的氟，久而久之就会导致全身慢性蓄积性中毒，其中氟骨症是对人体危害最为严重的一种骨病，虽然对它的研究层出不穷，但氟骨症发生的确切机制尚未完全清楚，亦无有效的药物对其进行防治，这不仅对患者的生活造成严重的威胁，也对病区所在的经济发展造成影响，因此氟中毒成为了我国严重的公共卫生问题[7-8]。在细胞层面低剂量的氟可以刺激软骨细胞的增殖，反之高剂量的氟可以诱导软骨细胞凋亡[9-10]。在分子层面低剂量的氟能刺激成熟成骨细胞的活性促进碱性磷酸酶、胶原酶、骨钙素等与骨骼发育代谢相关的酶和调节因子合成，但在高剂量氟的刺激下却呈现出相反的抑制作用[11]。在本研究结果中发现染氟72 时，5 mg/L 的NaF 对成骨细胞Saos-2 增殖活力较0mg/L 组有明显的促进作用,≥72 h时，20 mg/L 的NaF 对成骨细胞Saos-2 增殖活力较0mg/L 组有明显的抑制作用，随着NaF 剂量的增大和时间的延长对细胞增殖活力的抑制逐渐增强。研究结果与唐建军[12]的研究结果相一致,一定程度上低剂量的氟能刺激成骨细胞的活性,促进细胞增殖,高剂量的氟能抑制成骨细胞的活性，抑制细胞增殖。DNA 的甲基化和组蛋白修饰是基因表观遗传学发生改变的2 种主要方式。在DNA 甲基化的研究中发现甲基化水平与基因表达呈负相关，当DNA 甲基化程度越高时基因表达水平越低，反之甲基化程度越低基因表达水平越就越高[13-14]。本研究结果显示5 mg/L的NaF 作用后DNA 甲基化程度较0 mg/L 组明显的降低,≥20 mg/L 的NaF 作用后DNA 甲基化程度较0 mg/L组明显的增高。与文献[15-16]的研究结果基本一致。DNMT1 是将甲基转移到基因组DNA 的胞嘧啶核苷酸的酶,在DNA 复制后维持甲基化模式的主要酶，并表现出对半甲基化DNA的偏好。5 mg/L的NaF作用成骨细胞Saos-2 后DNMT1 的表达量较0 mg/L组明显降低，≥20 mg/L的NaF作用成骨细胞Saos-2后DNMT1 的表达量较0 mg/L 组明显升高，表明在一定剂量范围内低剂量的氟可能使DNMT1 表达量降低，导致成骨细胞Saos-2 的甲基化程度降低，高剂量的氟能促进DNMT1 表达，导致成骨细胞Saos-2 的甲基化程度增高。Runx2又称为核心结合因子α1，是脊椎动物成骨细胞分化的关键调节因子，能够激活骨形成相关基因的转录和表达，控制成骨细胞的成骨速率及进一步的成骨过程[17]。Osterix 是Runx2 的下游基因，促使成骨前体细胞转化为成骨细胞，Osterix 与Runx2 被认为是成骨细胞骨形成的标志基因。本研究发现5 mg/L 的NaF 作用成骨细胞Saos-2 后Runx2、Osterix的表达量较0 mg/L组明显的增高，≥20 mg/L的NaF 作用成骨细胞Saos-2 后Runx2、Osterix 的表达量较0 mg/L 组明显的降低。由此可见，一定剂量范围内的氟，低剂量降低了成骨细胞Saos-2 DNA 的甲基化，促进了Runx2、Osterix 基因的表达，高剂量的氟增高了成骨细胞Saos-2 DNA 的甲基化，抑制了Runx2、Osterix基因的表达。

图2 不同剂量NaF对成骨细胞Saos-2作用后对DN MT1、Runx2、Osterix基因表达的影响

综上所述，低剂量的氟可能降低了成骨细胞Saos-2 DNA 的甲基化，促进Runx2、Osterix 基因的表达，导致细胞增殖活跃。高剂量的氟增高了成骨细胞Saos-2 DNA 的甲基化，抑制了Runx2、Osterix 基因的表达，导致细胞增殖受到不同程度的抑制。随着对氟对DNA 甲基化作用的深入研究，其在生物学功能的多样性和复杂性日益凸显，受到多种层面的调控，但它能为DNA 甲基化在氟中毒的复杂致病机制提供理论依据和治疗的新思路、新方法。