玻璃化解冻和慢速解冻在程序化冷冻胚胎解冻移植中的比较研究

2021-01-29王建业唐宁吕丹

中国计划生育和妇产科 2021年1期

王建业，唐宁，吕丹

玻璃化冷冻是生殖医学领域应用最广也是最为普遍的冷冻方式，它广泛应用于卵裂期胚胎、囊胚期胚胎、卵母细胞，甚至是精子的冷冻[1-5]，极大地提高了冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer, FET )周期患者的胚胎复苏率和患者的累计妊娠率[6-7]，保障了FET周期患者成功率，减少了患者并发症，也进一步降低了不孕不育患者治疗的总费用。但早期不孕不育患者在接受体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治疗时多采用程序化的冷冻方式，对于这部分胚胎如果按照标准的慢速解冻(slow thawing, ST)方式进行操作，解冻后胚胎有较高的卵裂球坏死率，胚胎利用率相对较低；按照玻璃化解冻(vitrificative thawing, VT)方式解冻玻璃化冷冻的胚胎，解冻后胚胎存活率高，胚胎利用率也相对较高[8-9]。但是否能用VT方式解冻程序化冷冻的胚胎，目前还在探讨之中。本研究将比较VT和ST对程序化冷冻胚胎的影响，以期为程序化冷冻胚胎寻求更好的解冻方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为2016年1月至2018年12月解放军第九六〇医院生殖中心接受IVF-ET技术进行助孕治疗的胚胎解冻移植患者。使用随机数生成软件产生随机分组数值，患者按照就诊先后顺序所对应的随机数分为VT组(200例，解冻液使用日本加藤的玻璃化解冻液)和ST组(200例，解冻液使用Quinn’s的慢速解冻液)。两组患者夫妇的胚胎在冷冻时均为程序化冷冻方式。纳入研究的患者年龄<37岁，不孕原因为输卵管因素，超促排卵方案为短方案。所有患者均按照医院生殖伦理委员会要求，每一步操作都签订相应的知情同意书。

1.2 方法

使用本中心常规方法，但略有改进[10]，具体如下。

1.2.1 超促排卵采用本生殖中心常规超促排卵方案，当主导卵泡直径达18 mm时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 U。

1.2.2 取卵、受精和胚胎观察 hCG注射后36 h在超声引导下经阴道取卵，取卵后3～5 h行体外受精(in vitro fertilization，IVF)，19～20 h观察受精情况，6～7 h行卵胞浆内单精子注射( intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，17～18 h观察受精情况。授精后68～70 h观察胚胎卵裂球和碎片数量，并以此判定卵裂期胚胎的级别。① Ⅰ级胚胎：卵裂球大小均匀，胞浆碎片<10% ；② Ⅱ级胚胎：卵裂球大小略不均匀，胞浆碎片<15% ；③ Ⅲ级胚胎：胞浆碎片<50%，卵裂球情况类似于Ⅱ级胚胎；④ Ⅳ级胚胎：胞浆碎片>50%。胚胎达6细胞以下，胚胎评级降低一个级别。解冻后胚胎有卵裂球死亡，胚胎评级降低一个级别。Ⅰ级和Ⅱ级胚胎为优质胚胎。Ⅰ～Ⅲ级胚胎为可用胚胎。两组胚胎均在Labotect C 200培养箱中培养。所有洗精和受精用培养液均使用Vitro Life产品。

1.2.3 所有解冻移植胚胎均使用程序化冷冻方法。

1.2.4 移植日测定患者子宫内膜厚度，低于10 mm不予移植，不计入本研究统计范围。

1.3 观察指标

① 比较两组患者最初进入IVF-ET周期时的基本情况，包括年龄、不孕年限、获卵数、促性腺激素(gonadotropins，Gn)用量和基础促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone，FSH)值；② 比较两组患者最初进入IVF-ET周期时胚胎发育情况，包括MⅡ卵率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、可用胚胎率和冷冻胚胎率；③ 比较两组患者胚胎复苏情况，包括胚胎复苏完整率和复苏可用率；④ 比较两组患者胚胎移植情况和临床妊娠结局，包括胚胎移植日移植次数、移植胚胎数、内膜厚度和临床妊娠结果。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 患者基本情况

所有患者均曾在中心接受IVF助孕。最近一次IVF周期检查显示：两组患者年龄、不孕年限、获卵数、Gn用量和基础FSH值差异均无统计学意义(P>0.05)，详见下页表1。

2.2 胚胎发育情况

最近一次IVF周期胚胎发育情况显示：两组患者MⅡ卵率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、可用胚胎率和冷冻胚胎率差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

2.3 胚胎复苏情况

VT组患者胚胎复苏完整率和复苏可用率明显高于ST组，两组差异均有非常显著的统计学意义(P<0.001)，详见表3。

2.4 胚胎移植及妊娠结局

胚胎移植日，两组患者移植次数、移植胚胎个数和子宫内膜厚度、移植后两组患者临床妊娠率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见78页表4。

3 讨论

自1978年第1例试管婴儿诞生以来，越来越多不孕不育患者受益于辅助生殖技术。在众多的辅助生殖技术中，冷冻和解冻技术是最重要的技术之一，最常用的冷冻和解冻方法包括程序化冷冻与ST及玻璃化冷冻与VT。程序化冷冻是最早使用的冷冻方法，采用“植冰”方式防止细胞内冰晶形成，使用麦管作为冷冻载体，程序化降温方式；玻璃化冷冻是后来使用的冷冻方法，采用高浓度冷冻保护剂，在极速降温中形成玻璃态方式防止细胞内冰晶形成，使用冷冻环、冷冻钩或者冷冻片作为冷冻载体，急速降温方式。ST使用冷冻保护剂梯度递降的方式置换细胞内外液体，避免解冻时的冰晶损伤；VT同样使用冷冻保护剂梯度递降的方式置换细胞内外液体，避免解冻时的冰晶损伤。现在多数学者和临床胚胎学家认为，玻璃化冷冻更适合胚胎的冷冻保存，玻璃化冷冻和解冻应该全面代替程序化冷冻和ST[11-12]。只是两种解冻方式使用的冷冻保护剂有所不同。这为我们使用VT方式代替ST方式，解冻程序化冷冻的胚胎，提供了一定的理论基础。

本研究中，所有进入冷冻周期的患者都是最近接受IVF周期并有冷冻胚胎，随机数分配形成VT组和ST组。两组患者在年龄、不孕年限、获卵数、Gn用量和基础FSH值方面没有差异，有共同的比较基础。进一步的胚胎发育比较显示MⅡ卵率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、可用胚胎率和冷冻胚胎率差异无统计学意义。而在影响冷冻和解冻的因素中，胚胎质量和数量非常重要，胚胎发育的一致性使得两组在比较解冻方法对冷冻效果的影响上有了较好的共同基础，增加了比较的可行度。解冻结果显示VT组患者胚胎复苏完整率和复苏可用率明显高于ST组，这表明了VT能达到比ST较好的解冻结果，这也意味着解冻同样数量的冷冻胚胎，经过VT可以获得更多的优质胚胎和可用胚胎用于胚胎移植。在实际的临床实践中，我们总是尽可能的保证在一次移植时有两个优质胚胎，因此使用慢速冷冻意味着要解冻更多的胚胎。本研究中VT组解冻了523个胚胎，而ST组则解冻了603个胚胎。80个胚胎可能来自ST组解冻后的不可用胚胎，也可能来自复苏后的多余可用胚胎。这表明ST不仅会造成更多的胚胎坏死，而且考虑到随后的胚胎移植，还会造成更多的胚胎浪费。由于两组患者的移植次数、移植胚胎个数和子宫内膜厚度没有差异，移植后的临床妊娠率也没有差异，但VT组移植胚胎数(2.13±0.26)还是略低于ST组(2.48±0.42)，而VT组临床妊娠率(55.0%)却略高于ST组(53.5%)，这表明VT比ST对临床妊娠结果有一定提高，虽然这种提高并没有明显的统计学意义。