miR-486-5p对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用及机制研究

徐婷婷 冯海英 朱振华

[摘要] 目的 研究观察微小核糖核酸-486-5p（miR-486-5p）对博莱霉素致肺纤维化（PF）小鼠中的作用及机制。 方法 选取健康、清洁级雄性C57BL/6小鼠40只，10只分为正常组，剩余30只建立博莱霉素致PF模型，为模型组、miR-486-5p低表达组、miR-486-5p过表达组，各10只。检测miR-486-5p表达，观察病理组织，统计肺指数、HYP含量，检测FN、α-SMA蛋白表达及TGFβ1/Smad通路相关蛋白。 结果 miR-486-5p过表达组miR-486-5p表达高于模型组、miR-486-5p低表达组（P<0.05）。miR-486-5p过表达组肺指数、HYP含量低于模型组，FN、α-SMA、TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表达低于模型组（P<0.05）;miR-486-5p过表达组肺指数、HYP含量以及FN、α-SMA、TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表达低于miR-486-5p低表达组（P<0.05）。 结论 miR-486-5p过表达调控TGFβ1/Smad信号通路对博莱霉素致PF小鼠肺纤维化有抑制作用。

[关键词] 微小核糖核酸-486-5p;博莱霉素;肺纤维化;作用机制

[中图分类号] R563.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）34-0024-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of microRNA-486-5p （miR-486-5p） on bleomycin-induced pulmonary fibrosis（PF） in mice and its underlying mechanism. Methods Forty healthy， clean-grade male C57BL/6 mice were selected， 10 of which were assigned into the normal group， and the remaining 30 were used to establish bleomycin-induced PF models and were divided into the model group， the miR-486-5p low expression group and the miR-486-5p overexpression group， with 10 mice in each group. The miR-486-5p expression was detected， and the pathological tissue was observed. In addition， the lung index and hydroxyproline （HYP） content were counted， and the expression of fibronectin （FN） and α-smooth muscle actin （α-SMA）， and transforming growth factor-β1 （TGFβ1）/Smad pathway-related proteins were detected. Results The miR-486-5p expression in the miR-486-5p overexpression group was higher than that in the model group and the miR-486-5p low expression group（P<0.05）. The lung index and HYP content in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the model group， and the expressions of FN， α-SMA， TGFβ1， Smad2 and Smad3 protein in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the model group（P<0.05）. The lung index， HYP content， and the expressions of FN， α-SMA， TGFβ1， Smad2， and Smad3 protein in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the miR-486-5p low expression group（P<0.05）. Conclusion The miR-486-5p overexpression plays a role of inhibiting bleomycin-induced PF in mice through regulating the TGFβ1/Smad signaling pathway.

[Key words] microRNA-486-5p; Bleomycin; Pulmonary fibrosis; Mechanism

肺纖维化（Pulmonary fibrosis，PF）属于一种慢性炎症反应疾病，患者主要表现为弥漫性肺泡炎、间质纤维化等，且近年来显示其发病率逐年增加，患者5年生存率低于50%[1]。目前临床关于PF发布机制较为复杂，主要通过糖皮质激素、免疫抑制剂等治疗，但治疗效果不理想[2]。目前，在动物研究中常常通过气管运送博莱霉素建立肺纤维化模型，模拟人特发性肺纤维化疾病，研究其发病机制[3]。已经有研究证实，在肺纤维化发病过程中，涉及到多种细胞因子、基因等复杂网络调控，微小核糖核酸（miRNAs）在肺纤维化发生中至关重要[4]。已有研究证实，在矽肺及特发性肺纤维化患者血清和肺组织中，miR-486-5p表达下调，可作为早期肺纤维化疾病标志物[5]。目前临床缺乏miR-486-5p参与肺纤维化作用机制，因此本研究旨在探讨miR-486-5p对博莱霉素致PF小鼠的作用及机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源

选取健康、清洁级雄性C57BL/6小鼠40只，体质量20～25 g，均由赛业（固安）生物科技有限公司提供，SYXK（冀）2021-005。鼠龄为6～8周。所有小鼠均给予常规饲养，自由饮水，黑/白光照交替12 h，温度为20～25℃，湿度为40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 博莱霉素致PF模型建立  40只小鼠随机选取10只作为正常组，剩余30只参考文献[6]建立博莱霉素致PF模型，小鼠麻醉苏醒后常规饲养21 d。

1.2.2 分组及干预  30只模型小鼠随机分为模型组、miR-486-5p低表达组、miR-486-5p过表达组，各10只。腺病毒载体Ad-miR486及空载腺病毒（由上海汉恒生物公司提供）。miR-486-5p过表达组使用微量注射器给予75 μL携带miR-486-5p腺病毒溶液（正义链：TGGGATCCATGAGGAAGGGACATGAAGA;反义链：ACCGAAGCTTAAAAAAGCTCGGTCCCAGAGTCAG）;miR-486-5p低表达组使用给予75 μL腺病毒载体溶液（正义链：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT;反义链：ACGUGACACGUUCGGAGAATT）;模型组、正常组两组均给予75 μL的生理盐水干预，直接注射到肺组织中，各组均连续干预5 d。

1.3 观察指标

1.3.1 miR-486-5p检测  取小鼠尾部静脉血3 mL，3000 r/min离心10 min，取得上层血清，放置-20℃冻箱内备用。采用实时荧光定量PCR检测，严格按照逆转录试剂盒（TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit）逆转成cDNA操作说明书进行，2-ΔΔCT法对miR-486-5p表达水平分析。

1.3.2 病理组织观察  干预后5 d小鼠麻醉处死后，采集小鼠肺部组织，提取后采用生理盐水冲洗后，清除干净，吸干后制备切片，经过二甲苯脱蜡后，梯度酒精水化，苏木精染色5 min，流水冲洗后给予伊红染色30 s，观察。

1.3.3 统计肺指数、羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）含量  小鼠处死后取肺组织称重，生理盐水冲洗后吸干水分再次称重，肺指数=肺湿重/小鼠体质量。取适量肺组织匀浆采用碱水水解法检测肺组织中HYP含量。

1.3.4 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纤维连接蛋白（Fibronectin，Fn）表达检测  酶联免疫吸附测定法（ELISA），试剂盒购自北京北方生物技术研究所，试验操作严格根据说明书的步骤进行。

1.3.5 转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號通路相关蛋白检测  采用免疫印迹（Western blot）将标本提取液通过1000 rpm离心处理后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，120 000rpm离心处理，提取上清液，采用酶标仪检测TGFβ1、Smad2、Smad3 蛋白浓度，保存。滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加5 μL Marker、变性蛋白样品，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳;转膜成功后将硝酸纤维素膜（Nitrocellulosefilter membrane，NC）在5%的脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗（TGFβ1、Smad2、Smad3 1∶1000）孵育，经过震荡洗膜后加二抗（TGFβ1、Smad2、Smad3 1∶10 000），孵育，再次震荡洗膜，使用红外荧光成像系统对结果给予分析，以GAPDH为内参。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行分析处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差齐性检验，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠miR-486-5p表达比较

模型组、miR-486-5p低表达组miR-486-5p表达低于正常组，miR-486-5p过表达组miR-486-5p表达高于正常组（P<0.05）;miR-486-5p过表达组miR-486-5p表达高于模型组、miR-486-5p低表达组（P<0.05）。见图1。

2.2各组小鼠肺病理组织观察

正常组肺泡结构完整，肺泡中无炎症浸润;模型组肺泡结构紊乱，肺泡中有大量炎症细胞浸润，肺泡间隔变宽，有大量成纤维细胞出现;miR-486-5p低表达组肺泡结构、肺泡间隔等表现更为严重;miR-486-5p过表达组肺泡结构逐渐清晰，肺泡中炎症细胞浸润改善。见封三图2。

2.3 各组小鼠肺指数、HYP含量比较

模型组、miR-486-5p低表达组、miR-486-5p过表达组肺指数、HYP含量高于正常组（P<0.05）;miR-486-5p低表达组肺指数、HYP含量高于模型组，miR-486-5p过表达组肺指数、HYP含量低于模型组（P<0.05）;miR-486-5p过表达组肺指数、HYP含量低于miR-486-5p低表达组（P<0.05）。见表1。

2.4 各组小鼠FN、α-SMA蛋白表达比较

模型组、miR-486-5p低表达组、miR-486-5p过表达组FN、α-SMA蛋白表达高于正常组（P<0.05）;miR-486-5p低表达组FN、α-SMA蛋白表达高于模型组，miR-486-5p过表达组FN、α-SMA蛋白表达低于模型组（P<0.05）;miR-486-5p过表达组FN、α-SMA蛋白表达低于miR-486-5p低表达组（P<0.05）。见表2。

2.5各组小鼠TGFβ1/Smad信号通路相关蛋白相对表达量比较

模型组、miR-486-5p低表达组、miR-486-5p过表达组TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表达高于正常组（P<0.05）;miR-486-5p低表达组TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表达高于模型组，miR-486-5p过表达组TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表达低于模型组（P<0.05）;miR-486-5p过表达组TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表达低于miR-486-5p低表达组（P<0.05）。见表3、图2。

3讨论

博莱霉素属于一种抗肿瘤药物，其主要的不良反应是肺毒性，导致肺泡炎发生，发展为肺间质纤维化，通过博莱霉素诱导的肺间质纤维化模型病理特点与早期普通间质性肺炎及特发性肺间质纤维化相似[7-8]。

在动物实验研究中证实，miR-29、miR-200等均具有一定的抗纤维化作用[9-10]，但关于miR-486-5p抗纤维化作用研究较少。本研究结果显示，miR-486-5p过表达组miR-486-5p表达高于模型组、miR-486-5p低表达组，提示miR-486-5p过表达构建成功。PF主要病理变化主要体现在肺组织结构被破坏，伴随大量的炎性细胞浸润，成纤维细胞异常活化[11]。本研究中博莱霉素致PF小鼠肺组织HE染色发现，表现为弥漫性肺泡炎，肺泡中有大量炎性细胞浸润，说明博莱霉素致PF模型建立成功，与付钰等[12]研究结果保持一致。

肺指数能有效反映肺组织炎症、PF严重程度，HYP含量在肺组织胶原纤维中大量存在，其含量高低能反映肺组织胶原纤维变化，对胶原组织代谢有评估作用[13]。本研究结果显示，miR-486-5p过表达组肺指数、HYP含量明显降低，提示miR-486-5p过表达可以降低PF小鼠肺组织中HYP含量，有助于组织修复，抑制肺纤维化进程。FN主要存在于细胞外基质中，对成纤维细胞有趋化刺激作用，在肺纤维化过程中，FN会促进成纤维细胞增生，加快胶原细胞合成和转录[14]。张翠影等[15]研究指出，α-SMA蛋白在肺纤维化组织中显示高表达，与纤维化程度呈正相关。以上研究证实，FN、α-SMA蛋白参与肺纤维化发生过程。本研究结果显示，miR-486-5p过表达组FN、α-SMA蛋白表达下降，提示miR-486-5p过表达通过抑制FN、α-SMA蛋白表达，控制肺纤维化疾病发展。

本研究中肺成纤维细胞TGFβ处理后，会促进miR-155表达上调，成纤维细胞生长因子（FGF-7）属于miR-155靶基因，miR-155表达水平与博莱霉素致PF小鼠纤维化程度相关[16]。TGFβ信号通路在纤维化过程中至关重要，TGFβ1直接作用于成纤维细胞，促进其增殖，向肌成纤维细胞转化，大量细胞外基质释放，导致纤维化产生[17-18]。本研究结果证实，miR-486-5p过表达组TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表达降低，分析miR-486-5p作用机制为miR-486-5p下调TGFβ1表达，避免Smads蛋白发生磷酸化，避免介质Smad4蛋白形成三聚体，抑制肺成纤维细胞转化，减少肺组织中FN、α-SMA蛋白表达[19-20]。

综上所述，miR-486-5p过表达能改善博莱霉素致PF小鼠肺病理组织，降低肺指数、HYP含量及FN、α-SMA蛋白表达，通过调控TGFβ1/Smad信号通路相关蛋白，抑制小鼠肺纤维化，为临床研究肺纤维化疾病治疗提供有效的靶点。

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（收稿日期：2021-06-28）