产正丁醇脱氢酶微生物的筛选及其酶学性质的初步研究

郝媛，王东，特日格乐，杨德志，郭昊翔，陈忠军，孙子羽，满都拉*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学内蒙古农牧渔业生物实验研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018；3.内蒙古自治区国际蒙医医院创新蒙医药工程研究中心，内蒙古 呼和浩特 010020）

高级醇（higher alcohols）是酒精饮料中重要的香气成分之一，它除本身呈香外，还能与酸类结合形成酯，使酒精饮料具有独特的风味[1]。当酒中高级醇含量过高时，不仅会导致辛辣苦涩，也是饮用后造成头痛的原因之一[2-4]。因此，高级醇的含量必须控制在适当的范围内。目前，在传统酒类酿造过程中主要通过调控发酵温度[5]、微生物种类[6-7]、原辅料比[8]、添加糖化酶和蛋白酶[9-10]、蒸馏以及后陈化[11-12]等方式调控酒中高级醇的含量和种类。但由于传统酒类的酿造过程中涉及众多微生物的共同参与，工艺复杂，有关高级醇合成的机制尚未完全揭示，导致有关传统酒类发酵过程中高级醇的调控一直以经验式为主。

研究显示，乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenases，ADHs）在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）参与条件下能够将醇转化为相应的醛，这类酶在酵母及原核生物中广泛存在[13-15]，至少有25个EC编号的酶被称为醇脱氢酶[16]。酒精饮料可被视为一种以各种水溶性和非水溶性风味物质为溶质，以水和乙醇组成的混合体系为溶剂的非水相体系。在非水相体系中，醇脱氢酶以NAD+为辅酶依然能够完成醇的转化[17-19]。相关研究也证实从苹果皮渣中提取的酶能使白酒中高级醇含量降低[20-21]。在非水相体系中影响醇脱氢酶活性的因素除有机相本身的性质以外，底物性质、辅助因子浓度、水含量、初始pH值和温度等都对酶催化有重要影响[22-24]。

本文以正丁醇（n-butanol）为研究对象，拟通过分离筛选获得能够在乙醇存在条件下催化正丁醇的微生物，并研究影响其催化活性的因素，为进一步研究混合发酵过程中正丁醇的合成及建立调控酒类发酵过程中正丁醇含量的方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验菌从酒曲及发酵酒醅（北方某浓香型白酒企业）中分离获得。正丁醇、无水乙醇：天津永晟精细化工有限公司；NAD+辅酶（纯度>98%）：北京酷来博科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：广东环凯微生物科技有限公司；氯化钠：天津化学试剂三厂；琼脂、琼脂糖：US EVERBRIGHT。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-IID超声破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；Synergy H1全功能微孔板检测仪：美国伯腾仪器有限公司；PerkinElmer Clarus680气相色谱仪、TurboMatrix 40 Trap顶空进样器：珀金埃尔默有限公司；DYCP-31BN型琼脂糖水平电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 培养基

溶菌肉汤培养基（lysozyme nutrient broth base，LB）：胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母粉5 g、水1 L调pH值至 7.0后，121℃灭菌15 min。结合缓冲液（binding buffer）（mmol/L）：NaH2PO450 mol/L、NaCl 300 mol/L、咪唑10 mol/L，用NaOH调至pH 8.0；NAD+溶液：称取0.066 34 g NAD+，加10 mL超纯水，现配现用。正丁醇反应底物：100 mL水中加入0.3%正丁醇、3%乙醇；50×TAE缓冲液：24.2% Tris、5.71%冰醋酸、3.72%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）；1×TAE缓冲液：稀释50×TAE缓冲液。

1.4 方法

1.4.1 产正丁醇脱氢酶微生物的分离

取酒曲或酒醅1.0 g溶于无菌水中，振荡混匀后通过稀释涂布（LB培养基），分离纯种微生物。待稀释涂布培养基上长出菌落后，用接菌环分别挑取每个平板上所有形态及颜色不同的单菌落进行划线培养，并对菌落进行记录和编号，重复3次，直到获得单菌落为止。将获得的纯种微生物斜面保存备用。

1.4.2 粗酶液的制备

经液体LB培养后的微生物离心，弃上清，收集菌体。收集到的菌体用结合缓冲液清洗3次后，加入结合缓冲液重悬并混匀。重悬后的菌液在150 W、30 min、工作10 s、间歇15 s冰浴的条件下超声破碎。破碎后在10 000 r/min、30 min、4℃的条件下离心，取上清为粗酶液，4℃保存备用。

1.4.3 相对酶活力的检测

吸光值法：利用酶标仪在340 nm下测定反应体系10 min内吸光值变化，以吸光值的变化反映酶活大小[25]。顶空气相色谱法：以转化产物或底物的变化量指示酶活力。具体条件为：顶空恒定时间进样，载气、色谱柱压力 0.172 MPa（25psi）。温度：取样针 100 ℃、传输线100℃、炉温70℃。进样0.01 min、加压2 min、拔针0.1min、保温30min、气相色谱分析循环35min。气化室：温度250℃、分流条件1∶100。气体：载气N21 mL/min、补偿气30 mL/min、氢气45 mL/min、空气 450 mL/min。色谱柱：DB-wax 30 m×0.32 mm×0.25 μm，温度程序：起始40℃（5 min）、升温速率5℃/min、一阶温度100℃、升温速率10℃/min、二阶温度180℃（5 min）。检测器：FID、温度250℃、信号衰减-6。

1.4.4 产正丁醇脱氢酶微生物筛选

以粗酶液、NAD+溶液和底物混合组为处理组，以NAD+和酶液以及单独底物溶液为对照组，每组设3个平行。筛选方法：将筛得的菌株分别进行酶活检测，反应体系为酶液 25 μL、NAD+溶液 25 μL、底物 150 μL，设定3组平行。混匀后用酶标仪测定酶反应液第1分钟到第10分钟内在30℃下的OD340。

1.4.5 产正丁醇脱氢酶微生物的鉴定及生长曲线

以产酶菌株的基因组DNA为模板，采用16S rRNA基因通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3′）和 1492r（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3′）扩增16S rRNA基因。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系：2×Taq PCRMastermix 25 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 2 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR 条件为：第一阶段，94.0 ℃持续10.0 min。第二阶段，95.0℃持续0.5 s后55.0℃持续0.5 s，再在72.0℃持续1.5 min。第二阶段循环30次。第三阶段，72.0℃持续10 min后16.0℃持续2 min。PCR完成后，将PCR产物按顺序加入琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电压为120 V，电泳时间30 min。完成后置于凝胶成像仪下观察条带，根据Marker确定片段长度。将PCR扩增产物送至生工生物（上海）有限公司进行测序。生长曲线绘制：将菌种接种到300 mL液体LB培养基中，30℃、180 r/min振荡培养24 h。取试管，每管加入8 mL LB液体培养基，分别接入200 μL菌液，30℃、300 r/min 振荡培养。分别测定 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26 h 在 600 nm 波长处的 OD值。根据3次重复测定所得的数据求出平均值，以OD600做纵坐标，以培养时间做横坐标，绘制生长曲线。

1.4.6 影响酶活力的因素

培养基对酶活力的影响：取培养后的菌株，在分别加入3%乙醇、0.3%丁醇以及200 mL液体LB培养基中培养24 h，在1.4.2的相同条件下提取粗酶液，按照试验设计配制不同体系，用酶标仪测定反应液第1分钟到第10分钟内在30℃下的OD340。

温度对酶活力的影响：将得到的粗酶液在20、25、30、35、40、45、50 ℃分别与底物反应 3 min，30 ℃下测定OD340吸光度的变化，每个温度设3个平行。

pH值对酶活力的影响：分别配制不同 pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的底物，通过气相色谱仪检测不同pH值对丁醇转化的影响。

金属离子对酶活力的影响：在反应体系中分别加入终浓度为 1 mmol/L的不同金属离子（Fe2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+），充分反应后，通过气相色谱仪检测不同pH值对正丁醇转化的影响。

乙醇浓度对酶活力的影响：将反应底物中的乙醇含量调节为0%、5%、10%、15%、20%、25%，使用气相色谱检测丁醇、乙醇的含量。

1.4.7 数据分析及绘图

2 结果与分析

2.1 产正丁醇脱氢酶微生物筛选

从酒曲及酒醅中共分离出71株微生物，通过粗酶提取和酶活检测后，从中初步选出6株具有催化能力的菌株，分别为 DQ-54、DQ-43、DQ-32、PP-31、DQF-10和JN-4。

产正丁醇脱氢酶微生物的筛选及验证见图1。

菌株DQ-54和PP-31吸光值变化较大 （结果如图1A所示），但PP-31菌株生长缓慢，因此进一步研究选取菌株DQ-54进行后续试验。为了进一步确定所筛微生物具有丁醇脱氢活性，分别设置4种对照（酶对照组、乙醇对照组、底物对照组和乙醇加酶对照组）研究该酶的催化活力。结果显示，处理组的吸光值显著的高于其他4组，说明所筛酶具有醇脱氢能力，且在相同乙醇浓度（3%）下添加正丁醇（0.3%）能够显著影响吸光值的变化，说明该酶可能具有丁醇催化能力（结果如图1B所示）。为进一步确定所筛酶具有丁醇催化能力，利用顶空-气相色谱技术对上述结果进行了验证。结果显示，菌株DQ-54的粗酶液能够在乙醇存在的条件下（乙醇含量为1%）催化体系中的正丁醇（浓度为0.3%）。另外，从试验结果来看，该酶能够显著的降低乙醇和正丁醇的含量（P＜0.05），并将其转化为相应的乙醛和丁醛（如图1C所示）。

图1 产正丁醇脱氢酶微生物的筛选及验证Fig.1 Screening and validation of n-butanol-dehydrogenaseproducing microorganism

2.2 菌株DQ-54的鉴定及其生长规律

菌株DQ-54的系统发育树和生长曲线见图2。

图2 菌株DQ-54的系统发育树和生长曲线Fig.2 Phylogenetic tree and growth curve of DQ-54

以菌株DQ-54细胞破碎液为模板，利用通用引物（27f和1492r）扩展所筛微生物的16S rRNA，经测序后构建的系统发育树（N-J法）如图2A所示。从结果来看，所筛菌株DQ-54的16S rRNA片段与肠杆菌属（Enterobacter）微生物相似性较高（相似度99%），将菌株DQ-54初步鉴定为生癌肠杆菌（Enterobacter cancerogenus），还需进一步结合理化性质进行确认，这里将DQ-54产生的醇脱氢酶命名为Ec-54ADH。以LB液体培养基培养菌株DQ-54，每2 h取样后测定OD600值构建的生长曲线如图2B所示。菌株DQ-54的OD值在0～2 h时上升缓慢，2 h～8 h时，极速上升，为对数生长期，因此收集菌体应在8 h以后。12 h后菌体保持平稳状态，26 h后进入衰亡期。

2.3 影响酶催化活力因素的研究

2.3.1 乙醇浓度对Ec-54ADH催化正丁醇的影响

通过考察Ec-54ADH在不同浓度乙醇（0%～25%）下对正丁醇（0.3%）的催化活力，研究乙醇对Ec-54ADH催化丁醇活力的影响，结果如图3所示。

合同管理是建筑企业管理的重要内容，也是降低工程成本，提高经济效益的有效途径。工期合同的进度要求是可以直接影响到工程施工质量的，但是在正常时空中，并不是能一切都能按照原计划进行，众所周知，工期如果出现变动会提高施工成本问题，所以，管理人员要对合同要求有全面的了解。在施工之前，管理人员和工程设计方案部门进行好对接，并且制定出良好的施工流程[3]。

随着乙醇浓度的增加，Ec-54ADH对正丁醇和乙醇的催化活力都逐渐减弱，但在乙醇浓度为25%时Ec-54ADH依然表现出了对乙醇的催化活力（乙醛浓度为65.552 mg/L），而对于正丁醇已经丧失了催化活力。当体系中不存在乙醇时Ec-54ADH对正丁醇具有最高的催化活力，在乙醇浓度为5%～20%之间时Ec-54ADH依然具有催化正丁醇的活力。这些结果显示，乙醇浓度增加使Ec-54ADH对正丁醇催化特异性有很大的影响。随着乙醇浓度的增加，Ec-54ADH依然具备醇脱氢能力，催化乙醇转化为乙醛，但对正丁醇转化能力逐渐降低，直至丧失（25%乙醇）。

图3 乙醇浓度对Ec-54ADH催化的影响Fig.3 The effect of ethanol on the activity of Ec-54 ADH

2.3.2 温度及添加乙醇培养对Ec-54ADH催化活力的影响

温度和培养基中添加乙醇对Ec-54ADH催化活力的影响见图4。

通过设置不同温度（25℃～50℃）考察Ec-54ADH在不同温度下催化丁醇的活力，结果显示（图4A），Ec-54ADH的催化活力随着温度升高先升高后降低，最适温度为40℃（p<0.05），所设置的温度中，25℃时酶活力最差。添加3%乙醇为处理组，添加等体积蒸馏水为对照组来考察在培养过程中添加乙醇对菌株DQ-54产醇脱氢酶的影响，结果如图4B显示，添加乙醇培养的菌株DQ-54的Ec-54ADH催化活力与对照相比显著降低（p<0.05）。为进一步研究培养基添加乙醇对DQ-54生长的影响，设置不同浓度乙醇培养（0%～15%）后发现（图4C），添加3%的乙醇能够显著抑制DQ-54的生长（p<0.05），添加量大于6%时DQ-54基本停止生长。

图4 温度和培养基中添加乙醇对Ec-54ADH催化活力的影响Fig.4 Effect of ethanol added in medium and temperature on catalytic activity of Ec-54ADH

2.3.3 pH值和金属离子对Ec-54ADH催化活力的影响

pH值和金属离子对Ec-54ADH催化活力的影响见图5。

pH值通过影响酶和底物的带电特性来影响酶的活性中心与底物的结合能力，从而影响酶的催化活性。适宜的pH值能够促进底物与酶的结合，有利于酶的催化作用。从试验结果来看，Ec-54ADH催化正丁醇的最适pH值为7，当pH值大于8时，酶的活力显著降低（图5A）。5种金属离子对正丁醇的转化均无促进作用，添加金属离子后正丁醇含量均显著高于对照组，丁醛含量显著低于对照组（图5B）。结果表明，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对丁醇转化均有抑制作用，而 Cu2+几乎完全抑制酶的活力。

图5 pH值和金属离子对Ec-54ADH催化活力的影响Fig.5 Effect of pH and metal ions on catalytic activity of Ec-54ADH

3 讨论

醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用[26]。在生物催化领域，已有采用3种脱氢酶催化二氧化碳转化甲醇，从而开辟二氧化碳应用新途径的报道[27]。醇脱氢酶在胞内代谢中具有重要的生理意义，可催化醇的氧化或酮、醛的还原。有研究表明，正丁醇可通过氧化反应生成正丁醛，醇氧化为醛的机理：ROH+[O]→RCHO+H2O[28-29]。利用苹果中的醇降解酶降解正己醇的报道显示，添加来源于苹果的醇脱氢酶能够显著降低白酒中的正己醇[21，30-31]。将地霉属（Geotrichum）菌株添加到葡萄酒和白酒中，通过气质联用发现，酒样中高级醇含量均有下降。其中，1-丁醇转化为丁酸丁酯，3-甲基-1-丁醇（异戊醇）转化为3-甲基丁酸[32]。本研究中，通过分离纯化得到一株肠杆菌属（Enterobacter）细菌，具有能够在乙醇存在条件下（5%）催化正丁醇转化为正丁醛的能力。肠杆菌属微生物是白酒酿造过程中常见微生物[33]。因此可以推论，在传统酒酿造过程中，正丁醇的产生与进一步代谢不仅与酿酒酵母关系密切[2]，与肠杆菌属细菌可能也具有一定的关系，肠杆菌属微生物在丁醇的产生过程中起到一定的作用。经过NCBI数据库检索发现，Enterobacter cancerogenus CR-Eb1（CP025225.1）基 因组中共有8个基因注释为具有醇脱氢酶活性。本研究中的粗酶液可能是这些酶的混合物，需进一步深入研究。从试验结果来看（图3），随着乙醇浓度的增加（0%～25%），Ec-54ADH对正丁醇的催化能力逐渐减弱，但是依然具有乙醇脱氢的能力。这个结果在一定程度上可以解释，在酒类发酵过程中高级醇积累与乙醇浓度相关的原因。随着发酵的进行，体系中乙醇的浓度逐渐增加，使原本能够催化高级醇的酶的特异性改变，对高级醇的催化能力减弱。相关研究也证实高级醇是与乙醇偶联产生的，在发酵后期逐渐积累[34]。

酒可视为一种由乙醇和水组成的非水相体系。其中的风味物质是该体系中的溶质。乙醇属于亲水性溶剂，Zaks等发现酶的活性在疏水性溶剂中比在亲水性溶剂中更高[35]。由Narayan等报道可知，重要的是疏水性，而不是极性或与水的混溶性[36]。如果底物更易溶于溶剂，则底物分子将难以被酶利用，溶剂介质的性质会影响酶的对映选择性和区域选择性[37]。本研究中，高浓度乙醇下Ec-54ADH对正丁醇的催化能力逐渐减弱可能因为乙醇影响了Ec-54ADH的选择性，乙醇浓度增加使正丁醇更难与酶接触。因为正丁醇的疏水性高于乙醇，而高浓度的乙醇能够使正丁醇溶解在体系中，不能靠近酶。

在传统白酒酿造过程中，水质对白酒的品质影响较大。水中的金属离子能够影响微生物的生长和酶催化活性。金属离子在生物体内发挥着多种功能，部分金属离子转移到特定部位成为金属酶的活性中心或生物大分子的结构组成部分对其在体内的平衡也起到一定作用[38-40]。研究显示，Fe2+和Zn2+对醇脱氢酶有重要作用[41]。本研究中，模拟自然发酵状态下（乙醇浓度为 3.00%），额外添加金属离子（Fe2+、Mg2+、Mn2+、Zn2和Cu2+）对正丁醇转化的影响。结果显示，额外添加一定浓度的金属离子（1 mmol/L）均能够影响Ec-54ADH对正丁醇的催化能力，使其催化能力下降。其中，Cu2+能够显著抑制Ec-54ADH的催化活力。因此，在酒类发酵过程中金属离子的种类对高级醇的合成与代谢有一定的影响。

本研究的目的是筛选出一株能够在乙醇存在条件下转化正丁醇的酶。结果显示，虽然所筛Ec-54ADH能够在乙醇存在条件下转化正丁醇，但随着乙醇浓度的增加对正丁醇的催化能力逐渐减弱。这就需要在后期对酶进行适当的修饰与改造，以提高其应用能力[42-43]。对于醇脱氢酶的应用来说，辅酶再生是实现氧化还原酶催化反应的必须步骤，是关系到氧化还原酶工业应用的关键[44]。

4 结论

本研究经过筛选和验证得到了一株能够产生丁醇脱氢酶的微生物。该微生物所产的丁醇脱氢酶能够在乙醇存在条件下催化正丁醇，乙醇含量为5.00%时依然具有催化正丁醇的能力，但随着乙醇浓度的增加，该酶对正丁醇的催化能力逐渐减弱。在乙醇存在条件下，该酶的最适催化温度为40℃、最适pH值为7，额外添加金属离子能够降低该酶催化正丁醇的能力。这为进一步开发利用该酶及建立调控成品酒类生产中正丁醇含量方法奠定基础。