火麻仁油总酚含量福林酚测定法的优化

谭晓舒，吴建文，梨贵卿，汤星月，陆顺忠，李秋庭*

（1.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530006）

食用植物油脂中含有的油脂伴随物如植物酚类、维生素E、植物甾醇、矿物质、角鲨烯等物质对油脂的营养、保健、食疗等功能价值有重要影响。油脂伴随物含量成为评价油脂品质和加工方法优劣的重要指标。油脂中的植物多酚具有抗氧化、抗炎、抗血栓形成、抗动脉粥样硬化及舒张血管等功效[1]，亦对油脂本身的氧化稳定性起积极作用[2-4]，因此植物多酚是一些功能性、疗效性油脂常检测的成分。

目前广泛采用的植物油总酚含量的测定方法是1927年Folin等[5]提出的福林酚比色法，其原理为酚类物质与福林酚试剂（磷钼酸-磷钨酸）在碱性环境下发生氧化还原反应，生成蓝色的还原态钼[6]，最大吸收波长在760 nm附近，且吸光值与酚羟基浓度成正比。与高效液相色谱法[7-8]和高效毛细管电泳法[9]相比，福林酚法具有快速、简单、廉价的优点。甲醇、乙醇溶液常作为多酚提取溶剂，一些文献[10-12]或先用正己烷溶解油样脱脂再用醇溶液提取酚类。Francesco等[13]在测定火麻油总酚时选用没食子酸和咖啡酸为标准品，国内文献多用没食子酸作为标准品[14]，而高麦瑞等[9]以簕菜茶为样品进行总酚测定时认为单宁酸是福林酚法测总酚的最佳标准品。由于样品极性的不同，标准品的选择对测定结果有影响[15]，因结果表达的不同，测定结果可比性低。此外，由于不同来源的植物油脂总酚含量及酚类组成差异较大[6]，容易因加入的碳酸钠和福林酚试剂的用量及比例不当产生白色的钨酸钠沉淀而影响后续的测定，因此，在福林酚法测定植物油总酚含量的过程中，需要对测定方法进行优化。

为充分开发广西长寿之乡的巴马火麻仁食品，本文以巴马火麻仁为原料，采用福林酚测定法开展了火麻仁油总酚含量的测定研究，对火麻仁油的多酚提取条件和测定过程进行了优化，该测定方法重复性和稳定性良好，为火麻仁油的酚类油脂伴随物的进一步研究提供可靠的分析方法，也为其他油脂中的酚类油脂伴随物的分析测定提供有效的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

广西巴马火麻仁：双益养生膳品公司，液压冷榨过滤后存于4℃冰箱内并尽快分析；福林酚试剂（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；没食子酸、单宁酸、咖啡酸（＞98%）均为分析纯：罗恩试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外可见分光光度计：日本岛津公司；80-2离心机：金坛市仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅：常州市朗博仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚提取液的制备

精确移取火麻仁油0.25 mL于10 mL离心管中，分别加入0.5 mL乙醇溶液、甲醇溶液或先加入0.25 mL正己烷溶解脱脂，再加入0.5 mL甲醇溶液，充分振荡，以4 000 r/min离心15 min，收集上清液，用上述提取溶剂定容至1.5 mL，即得多酚提取液。

1.3.2 对照品储备液的配制

精确称取咖啡酸、没食子酸和单宁酸各10 mg，分别用乙醇溶液溶解后用蒸馏水定容至10 mL，得到质量浓度为100 μg/mL的对照品储备液。

1.3.3 Folin-Ciocalteu分光光度测定法

参照申元福[16]的方法并做适当改动，分别取对照品储备液及样品溶液各0.5 mL于10 mL比色管中，先后加入2.5 mL稀释10倍的福林酚试剂（0.1 mol/L）、2.0 mL7.5%的碳酸钠溶液，充分混匀，黑暗处反应1 h，用紫外可见分光光度计在765 nm波长处测定吸光度值A，根据标准曲线计算样品中的总酚的含量，结果表示为没食子酸（gallic acid equivalents，GAE）当量浓度，即μg GAE/mL。

1.3.4 火麻仁油总酚提取条件的优化

1.3.4.1 提取溶剂的研究

准确移取火麻仁油0.25 mL，分别用0.5 mL 80%甲醇、乙醇与油样混匀2 min，或加入0.25 mL正己烷振荡溶解油样1 min，再加入0.5 mL 80%甲醇混匀2 min，以4 000 r/min离心15 min，重复提取两次后合并水相，分别定容至1.5 mL，按照1.3.3方法进行测定；以上步骤平行3次，根据测定结果确定提取溶剂。

1.3.4.2 提取溶剂浓度的研究

准确移取火麻仁油0.25 mL，分别用0.5 mL 65%、70%、75%、80%、85%溶剂（1.3.4.1中确定）提取多酚，离心及后续步骤同1.3.4.1，平行3次，确定提取溶剂浓度。

1.3.4.3 提取温度的研究

准确移取火麻仁油0.25 mL，用0.5 mL确定浓度的溶剂（1.3.4.2）在一定温度的水浴中进行提取，基于文献[17]及已有试验基础，提取时水浴温度分别设定为25、50、75℃，冷却后离心及后续步骤同1.3.4.1，平行3次，确定提取温度。

1.3.5 火麻仁油总酚测定条件的优化

1.3.5.1 检测波长的研究

分别移取0.5 mL多酚对照品储备液和火麻仁油多酚提取液，按照1.3.3方法进行反应，在665 nm～865 nm范围处测定吸光值（采样间距50 nm），平行3次，以确定最佳检测波长[16]。

1.3.5.2 福林酚试剂用量的研究

移取0.5 mL对照品储备液和多酚提取溶液，分别加入 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 福林酚试剂（0.1 mol/L）及2.0 mL质量浓度为7.5%的Na2CO3溶液，充分混匀，于暗处反应1 h，在检测波长处（1.3.5.1）测定吸光度，平行3次，确定福林酚试剂的用量。

1.3.5.3 Na2CO3溶液用量的研究

移取0.5 mL对照品储备液和多酚提取溶液，分别加入确定用量的福林酚试剂（1.3.5.2），再加入1.5、2.0、2.5、3.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，其余操作同 1.3.5.2，平行3次，确定7.5% Na2CO3溶液的用量。

1.3.5.4 试剂加入间隔时间的研究

移取0.5 mL对照品储备液和多酚提取溶液，加入选定用量的福林酚试剂（1.3.5.2），分别放置 0、3、5、10、15 min后，再加入确定用量的Na2CO3溶液（1.3.5.3），其余操作同1.3.5.2，平行3次，确定试剂加入的间隔时间。

1.3.5.5 暗反应时间的研究

移取0.5 mL对照品储备液和多酚提取溶液，在以上确定的条件下，将暗反应时间设为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，其余操作同1.3.5.2，平行3次，确定暗反应时间。

1.3.6 方法学评价

以没食子酸为标准品，绘制标准曲线，计算样品总酚含量，评价此优化方法的线性关系、准确性等。

1.3.6.1 标准曲线绘制

准确移取没食子酸储备液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，用乙醇溶液稀释成质量浓度为 10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL 的溶液。按照“1.3.5”优化的测定法操作，以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.6.2 加标回收率计算

配制10 mg/mL的没食子酸溶液，准确移取0.25 mL多酚质量浓度已知的火麻仁油3份，通过加入没食子酸溶液分别向已知油样中加入没食子酸300、400、500 μg，用0.5 mL 80%的乙醇提取3次，合并提取液定容至1.5 mL，按优化后的条件测定吸光度，计算总酚含量，根据总检出量减去样液含量再除以加标量计算回收率，再计算RSD（%），试验平行3次。

1.3.6.3 重复性

准确移取0.25 mL火麻仁油6份，按照已优化的多酚提取和测定条件操作，测定并计算火麻仁油总酚含量，考察测定方法的重复性。

1.3.6.4 稳定性

准确移取0.25 mL火麻仁油，按照已优化的多酚提取和测定条件操作，避光放置0～3 h，每隔0.5 h测定一次吸光度，计算RSD，分析该方法在一定时间内的稳定性。

1.4 数据统计与分析

试验数据用SPSS 25.0统计分析，通过Origin 2017绘图。

2 结果与分析

2.1 火麻仁油总酚提取方法的优化

2.1.1 提取溶剂的研究

不同溶剂提取火麻仁油中的总酚的结果如图1所示。

由图1可知，80%乙醇溶液对火麻仁油多酚的提取效果较为理想，以没食子酸当量来计为2 971.89 μg GAE/mL火麻仁油。试验过程中用正己烷溶解油样后油样的颜色变浅，再用甲醇溶液提取多酚时，多酚提取液与油样颜色接近，且较为浑浊，液体分层不明显，除杂除脂作用不佳，此结果与申元福[16]的研究结论相似。而用80%甲醇提取火麻仁油中的多酚，约为80%乙醇提取的总酚的1/3。Antonella等[18]用反向高效液相色谱-二极管阵列-荧光检测法对火麻仁油中的酚类物质进行定性，发现其中含41.74%的4′，5，7-三羟基黄酮（柚皮素），柚皮素是一种疏水性黄酮类化合物[19-20]，几乎不溶于水，可溶于乙醇[21]，甲醇比乙醇的极性大，可知乙醇对柚皮素等疏水性黄酮化合物的提取效果较好，与本试验结果一致，故选择乙醇为火麻仁油多酚类物质的提取溶剂。

图1 不同溶剂对火麻仁油总酚的提取效果Fig.1 Extraction effects of different solvents on total phenols of hemp seed oil

2.1.2 溶剂浓度的研究

不同溶剂浓度对火麻仁油进行多酚提取的结果如图2所示。

图2 不同浓度乙醇对火麻仁油总酚的提取效果Fig.2 Extraction effects of different concentrations of ethanol on total phenols in hemp seed oil

由于浓度为85%的乙醇溶液对火麻仁油进行多酚提取时，按步骤加入福林酚试剂后体系变浑浊，未达到测定吸光值需澄清透明的要求，考虑为福林酚试剂的醇溶性随乙醇浓度的增加而降低，故舍弃85%这一浓度提取结果。

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，酚类物质的提取效果越好，而用80%乙醇提取时，多酚含量显著升高，测定结果为3 110.21 μg GAE/mL火麻仁油，是用65%乙醇溶液提取的总酚含量的两倍，且反应后的溶液仍澄清透明，符合测定吸光值的要求，故选取80%作为乙醇提取浓度。

2.1.3 提取温度的研究

不同温度提取火麻仁油中的总酚的结果如图3所示。

图3 提取温度对火麻仁油总酚含量的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on total phenol content of hemp seed oil

由图3可知，在75℃下，提取的总酚含量仅为2 201.13 μg GAE/mL火麻仁油，考虑为在75℃附近，火麻仁油的酚类物质部分进行热分解，使得总酚含量降低。25℃下和50℃下，多酚提取效果相近，约为3 168.19 μg GAE/mL火麻仁油。在相近的提取效果下，出于经济和便捷的考虑，选择25℃作为火麻仁油的总酚提取温度。

2.2 火麻仁油总酚测定条件的优化

2.2.1 测定波长研究

没食子酸、单宁酸、咖啡酸对照品储备液及火麻仁油多酚提取液在665 nm～765 nm范围内以50 nm为采样间距进行吸光度测定，不同波长下的测定结果如图4所示。

由图4可知，对照品储备液的吸光值在665 nm～765 nm范围内缓慢上升，765 nm后吸光值缓慢下降，变化幅度较小（△A≤0.1），而火麻仁油多酚提取液的吸光度值随波长的变化较为明显（△A≤0.4），可见，单体酚与多酚混合物对波长的变化敏感度不同，这一结果与申元福等[16]的结论类似。由图4可知，没食子酸、单宁酸、咖啡酸对照品储备液及火麻仁油多酚提取液均在765 nm处有最大吸收值，故选取765 nm作为检测波长。

图4 样品与对照品溶液福林酚反应后不同波长下的扫描结果Fig.4 Scanning results of sample and reference solutions at different wavelengths after reacting with Foin-Ciocalteu reagent

2.2.2 福林酚试剂用量研究

把未经稀释的福林酚加入火麻仁油多酚提取液后易产生白色沉淀，且该沉淀加酸未产生气泡，考虑该沉淀为福林酚试剂中的钨酸钠，因其在乙醇中的溶解度较低，根据前期试验经验，将福林酚试剂稀释10倍使用。0.5 mL多酚提取液及对照品储备液内分别加入1.5 mL～4.0 mL的福林酚试剂，显色反应后的吸光度测定结果如图5所示。

图5 福林酚试剂用量对吸光度的影响Fig.5 Effects of the amount of Folin reagent on the absorbance

由图5可知，3.5 mL福林酚试剂分别与火麻仁油多酚提取液及单宁酸储备液反应，吸光度最大。而对于单体酚，1.5 mL福林酚试剂已能将储备液中的咖啡酸及没食子酸反应完全。Antonella等[18]、许春芳等[11]测定的火麻仁油的多酚提取物中含有柚皮素、染料木素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、表儿茶素、柚皮苷-7-O-葡萄糖苷等多种类型酚物质，考虑对种类丰富的多酚进行福林酚反应需要较多的福林酚试剂，3.5 mL福林酚试剂已与火麻仁油多酚提取液反应完全，继续增大福林酚试剂的用量反而稀释了反应生成的蓝色络合物，吸光度降低，故选取3.5 mL稀释10倍的福林酚试剂作为福林酚用量。

2.2.3 碳酸钠用量研究

在对照品储备液和火麻仁油多酚提取液中分别加入一定量的碳酸钠溶液，其吸光度的测定结果如图6所示。

图6 7.5%碳酸钠溶液用量对吸光度的影响Fig.6 Effects of 7.5% Na2CO3on absorbance

由图6可知，对照品储备液吸光度的测定值随碳酸钠的增加而减少，考虑1.5 mL 7.5%碳酸钠已能保证3种对照品体系的碱性环境，继续增加碳酸钠的用量时稀释了体系中蓝色络合物，故吸光值下降。而碳酸钠对火麻仁油的多酚提取液的影响不同，由图6可知，其他条件固定的情况下加入7.5%碳酸钠溶液的量为2.5 mL时，火麻仁油多酚提取液有最大吸光值，故确定7.5%碳酸钠溶液的最佳用量为2.5 mL。

2.2.4 试剂加入间隔时间研究

福林酚试剂与碳酸钠溶液加入间隔不同时间对吸光度的影响如图7所示。

图7 试剂加入间隔时间对吸光度的影响Fig.7 Effects of reagent addition interval on absorbance

由图7可知，福林酚试剂与碳酸钠溶液滴加的间隔时间为0 min时，没食子酸储备液反应后吸光度测定值最大；对咖啡酸储备液，间隔时间为15 min时，测得的吸光度最大；随试剂加入间隔时间的延长，单宁酸储备液的吸光值缓慢增大；对于火麻仁油多酚提取液，试剂加入间隔10 min时反应后样液的吸光度达到最大值，考虑复杂多酚及其混合物与福林酚试剂需要较长时间才能到达反应终点，而碳酸钠的作用是为络合物的形成提供碱性环境，到达反应终点后碳酸钠溶液加入越迟，吸光度越小，根据结果选择10 min作为试剂加入的间隔时间。

2.2.5 暗反应时间研究

试样及对照品显色反应避光处理不同的时间，吸光度的测定结果如图8所示。

图8 暗反应时间对吸光度的影响Fig.8 Effects of dark reaction time on absorbance

由图8可知，样品的多酚提取液与咖啡酸和没食子酸储备液均在暗反应1.0 h时有最大吸光值，而后吸光值达到平衡，单宁酸储备液最大吸光值出现在暗反应1.5 h时。考虑暗反应时间与酚类分子的空间结构有关，单宁酸不是单体酚的简单堆叠，缩合单宁酸分子中黄烷醇的2位通过碳-碳键与儿茶酚或苯三酚结合，整体有类似于网状的空间结构，使酚羟基暴露较为缓慢。咖啡酸和没食子酸均仅有一个苯环平面和一个羧基碳链，空间结构较为简单，易于酚羟基的暴露和进一步反应。许春芳等[11]研究结果指出，巴马火麻仁油中含有 238 μg/100 g 4′，5，7-三羟基异黄酮（染料木素）；Antonella等[18]亦指出火麻仁油中含有41.74%的 4′，5，7-三羟基黄酮（柚皮素），这两者分子结构上均有3个距离较近的酚羟基，与没食子酸相似，故样液暗反应达到终点的时间与没食子酸储备液相近。计算时吸光度的微小差距可导致总酚含量数值差异较大，因此确定本试验中火麻仁油多酚提取液暗反应时间为1.0 h。

2.3 方法学评价

从单因素试验结果可以看出，火麻仁油多酚提取液与单宁酸储备液出现吸光度最大值时福林酚试剂的使用量相同（3.5 mL）；与没食子酸和咖啡酸储备液吸光度最大值时暗反应的时间相同（1.0 h），故3种标准品仅在特定单因素下与样液显色情况相近。考虑咖啡酸溶液和单宁酸溶液均呈浅棕色，没食子酸溶液为无色，且前期试验中发现单宁酸和咖啡酸溶液的稳定性较差，久置后有少量晶体析出，故选择没食子酸为标准品进行所优化方法的评价。

2.3.1 标准品与吸光度线性关系

以没食子酸为标准品，根据已优化的测定条件绘制浓度为 10、20、30、40、50、60 、70、80 μg/mL 的标准曲线，得到线性回归方程：y=0.009 2x（r2=0.998 6），其中y为吸光度，x为没食子酸浓度（μg/mL）。可见，没食子酸浓度在10 μg/mL～80 μg/mL范围内与吸光度的线性关系良好。

2.3.2 加标回收率

以没食子酸为标准品，按低、中、高剂量向已知总酚含量的0.25 mL火麻仁油样品中加入一定量的没食子酸溶液（10 mg/mL），再对加标后样品进行总酚含量测定，与未加标样品进行对照，加标回收率/%=（加标后油样测定值-油样测定值）/加标量×100，结果如表1所示。

表1 加标回收率试验Table 1 Results of recovery experiments with spiked samples

由表1可知，平均加标回收率为104.41%，RSD为1.98%，说明该优化方法用于测定火麻仁油总酚含量较准确。

2.3.3 重复性

同一火麻仁油样品取样6次，对其进行多酚提取和总酚含量测定，结果表示为没食子酸当量浓度，即μg GAE/mL，该优化方法的重复性结果见表2。

由表2可知，重复测定同一火麻仁油样品的总酚含量，其平均值为3 432.12 μg/mL，测定值的RSD为2.20%，故该方法重复性良好。

表2 重复性试验Table 2 Results of repeatability experiments

2.3.4 稳定性

该方法的稳定性试验结果见表3。

表3 稳定性试验Table 3 Results of stability experiments

由表3可知，同一火麻仁油样品测定总酚含量后的0～3 h内，其吸光度平均值为0.536，RSD为0.92%，可见此方法稳定性良好。

3 结论

本文对火麻仁油的总酚提取和福林酚法测总酚的条件进行了优化，结果表明：对比了甲醇、乙醇及文献报道的先用正己烷溶解油脂除杂再加甲醇的酚类物质提取效果，探究了溶剂浓度和提取温度对酚类提取的影响，结果表明在室温（25℃）下用80%乙醇进行3次提取火麻仁油中总酚的提取效果最好。以火麻仁油多酚提取液及3种常用标准品（咖啡酸、单宁酸、没食子酸）为考察对象，对福林酚反应的检测波长、福林酚试剂用量、7.5%质量浓度的碳酸钠溶液用量、试剂加入间隔时间和暗反应时间进行了优化，得到优化后的测定条件是：检测波长765 nm，0.1 mol/L福林酚试剂3.5 mL，7.5%碳酸钠2.5 mL，试剂加入间隔时间10 min，暗反应时间1 h。对优化方法以没食子酸为标准品进行评价，结果表明没食子酸在 10 μg/mL～80 μg/mL质量浓度范围内与吸光度的线性关系良好：y=0.009 2x+0.0000（r2=0.9986），该方法测得加标回收率为（104.41±1.98）%；同一样品重复测定6次的RSD为2.20%，重复性良好；0～3 h内测定吸光度RSD为0.92%，稳定性良好，该方法可作为火麻仁油总酚含量测定的有效方法。优化后的福林酚法测得巴马火麻仁油的总酚含量为（3 432.28±2.21）μg GAE/mL，为火麻仁油开发提供有效的数据支撑。