杂质吸附固相萃取-液相色谱串联质谱法同时测定粮食中15种真菌毒素

刘笑笑 ，丁 辉 ，吴福祥 ，苗 茜 ，姬良亮 ，彭 涛 ，张菁菁 ✉

（1. 兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 741250；2. 甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心，甘肃 兰州 741250）

真菌毒素是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒次生代谢产物，目前已知的真菌毒素有400多种[1]。粮食作物比较容易被真菌霉毒素污染，对人类健康影响较大的有黄曲霉毒素（AFT）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等[2]，超过一定摄入量后会损坏人的肝功能、致癌、致畸并诱发免疫抑制性疾病[3]。世界卫生组织已将真菌毒素纳入食品安全体系重点监测对象[4]，我国 GB2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》也对上述几种真菌毒素在食品中的限量指标有严格的规定[5-8]。在自然情况下作物常常遭受多种真菌毒素污染，根据国家现行标准规定，需要同时采用几种检测方法进行多次实验分析，才能测得不同真菌毒素的含量，测定方法不仅繁琐，而且效率较低，因此，亟需建立多种真菌毒素同步检测方法[9-12]。

Anastassiades等提出 QuEChERS（Quick， Easy，Cheap， Effective， Rugged， Safe）法，即分散固相萃取法，但是针对复杂基质中多种毒素的提取仍有不足，杂质吸附固相萃取法被广泛应用于食品中有机残留污染物的检测，其中包括复杂的粮食及其制品[10-13]，液相色谱-串联质谱技术（LC-MSMS）具有更高的选择性和灵敏度，逐渐成为同步检测多种真菌毒素的主要手段[15]。

本研究将样品经过简单提取和稀释，利用杂质吸附固相萃取净化，优化了液相色谱与质谱条件，利用稳定同位素内标，建立了UPLC-MS-MS检测粮食中多种真菌毒素的方法[12，14-16]。本方法简单、快速、通量高、成本低，适用于大批量粮食样品中多毒素的快速、准确定量检测，可为粮食中真菌毒素的检测和污染风险评估工作提供技术保障，减少因真菌毒素残留带来的食品安全问题。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UPLC-MS/MS液相色谱-三重串联四级杆质谱仪，配电喷雾离子源：美国安捷伦1290-G6460；Milli-Q超纯水仪：德国默克密理博公司；氮吹仪：美国Organomation公司；Eppendorf5810R高速冷冻离心机：德国艾本德曼公司；BSA2202S- CW分析天平：梅特勒公司。

15种真菌霉毒素：黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素 B2（aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黄曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-deoxynivalenol，3-AcDON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-deoxynivalenol，15-AcDON）、展青霉毒素（patulin，PAT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（orchatoxin A，OTA）、T2毒素（T-2）、HT2毒素（HT-2），伏马毒素 B1（fumonisin B1，FB1）、伏马毒素B2（fumonisin B2，FB2）、伏马毒素B3（fumonisin B3，FB3）：奥地利 Biopure和美国Sigma公司；[13C15]DON、[13C17]-3-AcDON、[13C17]AFB1、[13C17]AFB2、[13C17]AFG1、[13C17]AFG2、[13C34]FB1、[13C20]OTA、[13C34]FB2、[13C24]T-2、[13C22]HT-2、[13C18]ZEN12种全碳同位素内标溶液：奥地利Biopure公司。

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯：德国默克公司；乙酸铵（分析纯）：国药集团；乙酸（色谱纯）：赛默飞；0.22 μm水系滤膜：天津津滕公司；实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

真菌毒素标准溶液配制：分别精密量取OTA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、FB1、FB2、FB3、T-2、HT-2、PAT、3-AcDON、15-AcDON毒素标准品1.000 mL，用乙腈各自定容至10 mL配制成标准储备液，分别移取上述标准储备液适量用乙腈稀释成浓度分别为100 ng/mL，10 ng/mL，3.0 ng/mL，10 ng/mL，3.0 ng/mL，500 ng/mL，250 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，200 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL的混合标准中间液。加入一定浓度同位素内标，配置成系列混合标准曲线。

1.2.2 样品前处理

制备：抽取有代表性的样品，用四分法缩减取200 g，粉碎后过0.4 mm孔径的分析筛，混匀，装入自封袋中，避光，备用。

提取：准确称取粉碎均匀的样品5 g（精确至0.001 g），于50 mL离心管中，加入25 mL1%乙酸酸化的 84%乙腈水溶液溶解，匀浆 1 min，加入3 g无水硫酸镁、2 g氯化钠脱水盐提取，震荡提取20 min，以提高提取率，震荡后立即涡旋混合1 min，在4 ℃、4 900 r/min离心10 min，使得完全分离，取10.0 mL上清液待净化。

净化：加入装有不同填料的净化管中，HLB柱先活化，再移取10 mL上清液过柱，弃去净化液，淋洗一边，甲醇洗脱，收集洗脱液，加入12种同位素内标混合液；PrimeHLB柱直接移取10 mL上清液过柱，收集净化液，加入12种同位素内标混合液；分别涡旋震荡混匀，于 40 ℃水浴，氮吹至近干，1.00 mL甲醇复溶，经0.22 um滤膜过滤，上机测定。对比不同组成及配比的净化柱，以目标物的回收率为评价指标。

1.2.3 液相色谱-串联质谱条件

1.2.3.1 液相色谱条件 Kinetex 2.6 μm Bipheny l100A 色谱柱（LCColumn 50×2.1 mm，2.7 μm，phenomenon），流动相：A：0.1%（V/V）甲酸的2 mmol/L 甲酸铵溶液、B：甲醇，流速：0.3 mL/min，进样体积：5 μL，柱温：35 ℃。液相色谱梯度洗脱程序如表1所示。

1.2.3.2 质谱条件 电喷雾离子（electrosprayionization，ESI）源：正离子、负离子分别扫描；离子源温度：正离子模式650 ℃，负离子模式600 ℃；气帘气：35 psi；碰撞气：中等；电喷雾电压：正离子模式：5 000，负离子模式：-4 500；Gas1：60，Gas2：65；其他质谱条件参见表2。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradientelution program

表2 质谱条件Table 2 Mass spectrometry conditions

续表2

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

采用直接进样的方式，分别对 15种浓度为100 μg/L的目标化合物优化其质谱条件。本试验分别在ESI+模式和ESI-模式下对15种真菌毒素进行全扫描，大多数化合物在ESI正极模式下都显示了大量的[M+H]+离子，HT-2毒素和T-2毒属于单端孢霉烯族毒素，其母离子都形成了[M+Na]+的形式，[M+Na]+的结合物灵敏度更高，因此上述2种毒素选择[M+Na]+作为母离子。试验表明，玉米赤霉烯酮和展青霉毒素在ESI-模式下响应更显著，其余 13种毒素均在ESI+下有响应，确定母离子后，母离子进入二级质谱得到各目标分析物碎片离子信息，确定定量离子对和定性离子对，优化各质谱参数，考虑到正负离子模式频繁转换易造成仪器不稳定，因此选择分段采集模式试验。15种真菌毒素优化的质谱参数见表 2，MRM 色谱图见图1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动性的选择

由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态下电离，因此流动相的种类和比例不仅影响目标化合物的保留时间和峰形，还会影响到目标化合物的离子化效率，从而影响灵敏度，本文考察了对比流动相A：0.1%甲酸水溶液-甲醇，B：乙酸铵0.1%甲酸水溶液-甲醇，C：甲酸铵 0.1%甲酸水溶液-甲醇对15种真菌毒素质谱响应的影响。结果表明，A为流动相，各毒素均有质谱响应。当流动相中存在乙酸铵且浓度增至5 mmol/L时，虽然大部分对照品离子响应加强，但FB1和FB2无响应。用C作为流动相时，各真菌毒素的色谱峰信号强度明显高于A和B，本文最终选择2 mmol/L甲酸铵0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动相。

2.2.2 色谱柱的选择

图1 15种真菌毒素的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of the 15 mycotoxins

同分异构体有相同的母离子和子离子，在质谱检测上会产生干扰，因此必须在色谱上实现基线分离才能准确的定性、定量分析。本研究比较了不同类型的C18色谱柱对两种毒素的分离效果，考察Aglient ZORBAX Elipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）、Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）、Phenomenon Kinetex Bipheny l100A 色谱柱(LCColumn 50×2.1 mm，2.7 µm)，3种色谱柱对15种真菌毒素的分离。Phenomenon Kinetex Bipheny l100A色谱柱对15种真菌毒素达到基线分离、峰形尖锐。同时也可以看出Phenomenon Kinetex Bipheny l100A色谱柱在20 min的洗脱梯度内对多数毒素能够实现较好地分离（见图 2中 C），因此最终选择Phenomenon Kinetex Bipheny l100A 色谱柱(LCColumn 50×2.1 mm，2.7 µm)。

图2 不同初始流动相对真菌毒素出峰的影响Fig.2 Effects of that gradient condition on the peak of the mycotoxins

试验发现，流动相起始的比例对目标物的分离有较大的影响，图2为三种梯度条件下15种真菌毒素的总离子流图。由图 2可知，A（起始比例为甲醇90%）和B（起始比例为甲醇50%）条件下，所有目标物出峰时间重叠，影响峰形，且无法分段采集，导致目标物响应降低。当水相起始比例为90%，按流动相梯度洗脱时（见表1），各化合物在15 min内依次分离（见图2中C），泵压在20 min时达到平衡。

2.3 前处理条件优化

2.3.1 提取条件优化

2.3.1.1 提取溶剂的选择 真菌毒素主要采用甲醇、乙腈或这两种溶剂与水以不同比例混合后作为提取剂。由于不同基质适应性不同，且15种真菌毒素理化性质差异较大，选择合适15种真菌毒素的提取溶剂至关重要，经查阅文献和标准，比较了 8种较为常见的提取溶剂：80%甲醇（MeOH）、50%乙腈（ACN）、70%ACN、84%ACN、80%MeOH 加入 1%乙酸（AA）、50%ACN 加入1%AA、70%ACN加入 1%AA、84%ACN加入1%AA对中药材中15种真菌霉毒素的提取效率，结果表明，大部分真菌毒素乙腈的提取率要显著优于甲醇的，乙酸的加入对 ZEN、OTA、FB3、DON、HT-2的提取率有显著提高，综合考虑8种提取剂对 15种真菌霉毒素的提取效果，选择84%ACN+1%AA作为提取剂。

2.3.1.2 助提取剂的选择 本试验中，选择84%ACN加入1%AA作为提取剂，向提取液中加入助提剂，可以提高提取效率。选择无机盐NaCl+MgSO4作为本试验的助提剂，可以促进分层，促使目标物进入有机相。分别考察当添加量为 NaCl（0、1、2、3、4、5 g）和 MgSO4（0、1、2、3、4、5 g）的添加量对提取效率的影响。结果表明：当NaCl为2 g时盐析效果最好，大部分真菌毒素能达到较高回收率，NaCl添加量再增加时提取率无显著变化，见图 4；MgSO4添加量为3 g时除水效果较好，大部分真菌毒素能达到较高回收率，MgSO4添加量再增加时提取率无显著变化，见图5；因此，综合考虑助提剂无机盐NaCl+MgSO4的添加量对15种真菌霉毒素的提取效果，选择2 gNaCl+3 gMgSO4作为本试验的助提剂。

2.3.2 净化条件的优化

图3 不同提取溶剂对15种真菌毒素的回收率的影响Fig.3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of 15 mycotoxins

图4 不同NaCl添加量对15种真菌毒素的回收率的影响Fig.4 Effect of different NaCl add on the recoveries of 15 mycotoxins

图5 不同MgSO4添加量对15种真菌毒素的回收率的影响Fig.5 Effect of different MgSO4 add on the recoveries of 15 mycotoxins

本研究以粮食为基质，利用 84%ACN加入1%AA作为提取剂，匀浆提取，并加入 2 gNaCl和3 gMgSO4助提剂，充分震荡萃取后，3 900 r/min离心，移取上清液，考察2种不同的固相萃取净化柱，考察添加标准下多种真菌毒素的回收率。HLB为反相固相萃取柱，对目标物进行吸附，将杂质进行淋洗除去，而Prime-HLB主要是将杂质吸附使目标物流出，不需要平衡活化可直接上样，简化和加速SPE流程。结果发现，2种净化柱对15种真菌毒素回收率较好，其中Prime-HLB对这2类真菌毒素的加标回收率范围为78.9%～101.1%，相对标准偏差在0.9%～5.1%，HLB柱净化获得的回收率在 58.5%～94.2%，相对标准偏差在 2.3%～12.0%。对比2种固相萃取柱，杂质吸附型固相萃取柱除HT-2毒素外，回收率均优于目标物吸附性固相萃取柱，主要是由于HLB柱并非对特定毒素具有专一吸附性，所以回收率的损失在净化过程中的目标物吸附以及杂质淋洗过程中都容易产生，具体结果见表 3。而玉米赤霉烯酮类毒素则需在酸性条件下净化获得的回收率较高，因此本试验选择Prime- HLB柱作为净化柱。

2.4 基质效应

基质效应是在提取基质中的目标物时，基质中的干扰物影响目标化合物的离子化，主要源于样品中的内源性组分和样品处理后引入的杂质。在ESI离子化模式下，化合物的质谱响应容易受到基质的干扰，影响定量检测的准确性。13C标记的稳定同位素内标与目标物有相同结构、化学性质和色谱质谱行为，因此也具有相同的基质效应，在进样之前加入稳定同位素内标能够补偿进样体积、ESI源的离子化效率、离子传输导致的目标物偏移，保证了质谱分析结果的准确性和稳定性。本研究将毒素的混合标准储备液用空白样品经处理所得提取液和甲醇溶液分别稀释，制得一定质量浓度的2种标准工作液，用相对响应值法（基质效应=空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值×100%，基质效应大于 1时，表现为基质增强效应；基质效应小于1时，为基质抑制效应）评价了15种真菌毒素在玉米、小麦和藜麦中的基质效应见表 4。结果表面黄曲霉毒素、脱氧镰刀雪腐菌烯醇毒素及伏马毒素等在三种基质中均有较强的基质抑制效应，T-2毒素和HT-2毒素在三种基质中均有基质增强效应，影响结果的准确性。因此，在所有样品和标液中加入稳定同位素，以毒素峰面积与对应毒素内标的峰面积比进行定量从而弥补真菌毒素的基质效应影响，考虑到 15-AcDon市面上没有稳定同位素出售，选择[13C17-3-AcDon作为内标物质。本实验采用的分散固相萃取技术提取 15种真菌毒素的提取率很高，提取回收率基本在 80%～120%之间，同时稳定同位素内标价格昂贵，因此选择在上机进样前加入稳定同位素。相比于样品提取前加入同位素内标，本方法大大减少了稳定同位素的使用量，节约了检测成本，又能够有效地补偿基质效应的影响，保证检测结果的准确。

表3 不同净化柱对15种真菌毒素的回收率的影响Table 3 Effect of different Multifunction Clean-up Column on the recoveries of 15 mycotoxin %

表4 玉米、小麦和藜麦的基质效应Table 4 Matrlx effects of 15 mycotoxins in maize, wheat and quinoa

2.5 方法学考察

2.5.1 方法的线性范围及检出限

将2.1中对照品配制标准曲线，向空白玉米、小麦及藜麦样品中添加不同量的真菌毒素标准溶液，按照样品处理方法进行前处理和检测，采用空白基质液逐级稀释方法获得各真菌毒素的检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），表 5列出 15种真菌毒素的线性范围、检出限、定量限。在各自的线性范围内，15种真菌毒素线性良好，相关系数R2均大于 0.996，检出限和定量限均低于欧盟及我国规定的粮食中真菌毒素的限量标准，满足限量检出要求。

表5 15 种真菌毒素的线性范围、相关系数、检出限、定量限Table 5 Linear relationships, LODs and LOQs of 15 mycotoxins

2.5.2 不同基质回收率及精密度

分别取藜麦、小麦、玉米的空白基质，添加低、中、高三个水平的15种真菌毒素混合标准溶液，进行前处理，测定回收率，每个水平均测定6次，计算 RSD，结果见表 5，15种真菌毒素 3个添加水平的回收率为 76.9%～116.1%，RSD为1.4%～10%。

为了进一步验证方法准确性，采用建立的检测方法对玉米基质标准物质（FAPAS04319玉米）进行检测验证。验证结果如表 7所示，8种真菌毒素的检测值均在标示范围内，表明本文所建立方法准确可靠。

表6 玉米、小麦和藜麦中15种真菌毒素的加标回收率和精密度（n=6）Table 6 Recoveries and ralativest and arddeviations (RSDs) of 15 mycotoxins in Maize, Wheatand Quinoa sample (n=6)

表7 基质标准物质玉米中8种真菌毒素的检测结果Table 7 Analytical results for the determination of 8 mycotoxins in maize reference materials ug/kg

2.6 实际样品测定

随机购买市售粮食 135批，在本文优化条件下进行测定，共有97批样品检出真菌毒素，检出率为71%，其中小麦中主要的污染毒素为DON、3-AcDON、15-ACDON、ZEN、FB1和FB2，玉米中主要污染毒素为DON、15-AcDON、ZEN、FB1，藜麦中主要污染毒素为 DON、OTA和 ZEN，多毒素同时污染现象较为普遍。最大浓度分别为小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇为1 425 μg/kg、3乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇为512.0 μg/kg、玉米中玉米赤霉烯酮为189.1 μg/kg、15乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇为451.0 μg/kg，见表8，同时检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇和黄曲霉 B1的玉米样品和空白样品的总离子流图见图 6，对于真菌毒素产生的原因及其对在粮食作物中的残留对人体的危害需进一步通过实验验证。

表8 实际样品中15种真菌毒素的检测结果Table 8 Analyt ical results for the determination of 15 mycotoxins in real sample ug/kg

图6 检出多毒素的玉米样品和空白样品的总离子流图Fig.6 Total ionflow diagrams of Maize samples and blank samples were obtained

3 结论

本研究通过优化提取溶液体系，有效提高粮食基质中15种真菌毒素残留的回收率，通过固相萃取净化，建立了回收率高、稳定性强的高效液相色谱-串联质谱法快速筛查和定量测定粮食中15种真菌毒素的方法。样品采用电喷雾多反应监测模式，以同位素内标法进行定量分析，15种真菌毒素在各自浓度范围内线性良好，线性相关系数均大于 0.996，检出限为 0.2～10，定量限为0.8～30，以藜麦、小麦、玉米三种基质分别进行3水平加标回收实验，回收率在76.9%～116.1%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～10.4%，通过对基质标准物质进行验证，检测结果均落在证书范围内，本方法实现多种真菌毒素的同时分析检测，稳定性高、灵敏度高、专一性强、再现性好，可实现粮食中15种真菌毒素的快速筛查和准确定量，为真菌毒素的检验检测提供了实用的技术手段。针对随机购买市售粮食135批，共有97批样品检出真菌毒素，检出率为71%，多毒素同时污染现象比较普遍，应当引起监管的重视。