扩散峰度成像评估兔恶性骨肿瘤髓内浸润范围及与病理指标的相关性研究

房亚军，周锐志，陈海松，徐文坚

原发性恶性骨肿瘤的发病率虽然不高，但其进展迅速，侵袭性强，复发率高，给患者生命健康及生活质量带来极大危害[1-2]。多数原发恶性骨肿瘤好发于儿童和青少年，约2/3为骨肉瘤，其余大部分属于尤因肉瘤家族[3-4]。过去单纯截肢术是肢体恶性骨肿瘤的唯一治疗手段，随着医学检查技术特别是MR新技术的发展，恶性骨肿瘤浸润范围判断的准确性得以提高。近年来骨骼和关节置换等保肢术辅以放、化疗逐渐代替了单纯截肢术，越来越多地被应用于临床。

恶性骨肿瘤在其生长过程中，肿瘤细胞蔓延、浸润生长，肿瘤远端边界不清。在肿瘤与正常组织之间存在着过渡的移行区，移行区为含有少量肿瘤细胞的微观浸润区及无肿瘤细胞的单纯水肿区。正确区分肿瘤边界的微观浸润区与单纯水肿区可避免截骨过度或截骨不足，最大程度保留正常骨组织，对外科保肢手术方案的制定及患者预后起着至关重要的作用。

目前，国内外关于MRI扩散峰度成像(diffusion kurtosis imaging，DKI)对骨肿瘤髓内浸润范围的报道相对少见，与组织病理学相对照的研究更少。本文采用兔VX2恶性骨肿瘤模型行MR扩散加权DKI序列成像，分析骨肿瘤不同区域DKI各参数间的差异，以及各参数与组织病理学指标之间的相关性，旨在探讨其对显示骨肿瘤髓内浸润范围的价值。

材料与方法

1.VX2模型兔的制备

选择从青岛食品和药物管理局购买的纯种雄性新西兰大白兔30只，月龄2个月左右，体重2～3 kg。于已麻醉的兔右侧胫骨近端较平坦处依次纵行切开皮肤、皮下筋膜、肌肉组织，注意避开血管，切口10～15 mm，最后剥离骨膜，暴露胫骨近端骨皮质。于胫骨平台下约20 mm钻孔，直径1～2 mm。采用24G医用头皮留置针将3～4块1 mm×1 mm肿瘤组织块送入髓腔，深度约1 cm。骨蜡封口、分层缝合，碘伏消毒，无菌纱布覆盖，包扎。术后3天连用青霉素40万IU/KG肌注，预防感染[5-8]。该实验经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

2.MRI检查方法

模型兔肿瘤生长14～21 d后行常规MRI及DKI扫描，扫描前麻醉模型兔以防产生运动伪影。MRI检查采用3.0T磁共振成像系统(Siemens MAGNETOM Prisma 3.0 T，Erlangen，Germany)，8通道兔线圈(上海辰光医疗科技股份有限公司)。模型兔取仰卧位，足先进，对兔右侧股骨下段至踝关节水平分别行冠状面、横轴面快速自旋回波(TSE)T1WI，选取胫骨最大切面行矢状面TSE-T1WI、TSE-T2WI、短时反转恢复抑脂序列(short tau inversion recovery，STIR)，然后采集MR扩散加权DKI序列图像，采用自由呼吸单次激发平面回波序列，在三个正交方向上施加扩散梯度，b值分别为0、1000、1500、2000 s/mm2。各序列的扫描参数见表1。

表1 MRI常规序列及DKI序列的扫描参数

3.MRI图像后处理

VX2骨肿瘤DKI原始DICOM图像经syngo.via传输至工作站，于西门子后处理软件MR Body Diffusion Toolbox v1 3.0 测量DKI各定量指标。选取包含肿瘤的最大矢状层面，以病理为金标准行严格点对点对照，并结合MRI STIR序列在肿瘤实性区、微观浸润区、单纯水肿区勾画大小约1 mm的感兴趣区(ROI)，注意避开肿瘤中央出血、坏死区。每个感兴趣区均放置3次，取其平均值获得各区域的平均扩散系数(average diffusion coefficient，MD)及平均峰度(average kurtosis，MK)。

4.病理检查

经兔耳缘静脉注入空气处死模型兔，于股骨中下段至踝关节水平离断患肢，冲洗干净，用骨锯机(KUGELTSG-CG，德国)沿胫骨长轴、对应MRI最大矢状面以层厚3 mm切片，固定24 h后于EDTA脱钙液中进行脱钙约一个月，经脱水、石蜡包埋行HE染色及免疫组化检查(CD31、VEGF)。

肿瘤大体标本对应兔胫骨MRI图像最大矢状层面，按照Karim法[9]间距5 mm网格状分割，坐标轴的水平轴平行于胫骨平台水平切线，编码1～9；纵轴平行于胫骨骨干长轴，编码A～X。根据大体标本与影像大小的比例关系确定影像图像的横纵坐标间隔(等比例)，实现MRI和病理图像的点对点对照研究(图1)。

图1 肿瘤大体标本及MRI图像Karim法分区。

HE染色病理图像于CaseViewer软件中找到肿瘤实性区、微观浸润区及单纯水肿区。400倍光镜下在实性区及微观浸润区随机选取3个视野，分别得到每个视野内肿瘤细胞核总面积与视野面积之比，取其平均值为肿瘤细胞密度(tumor cell density，CD)。微血管密度(microvessel density，MVD)计数参照Weidner法。CD31抗体免疫染色玻片于100倍光镜下找到微血管分布区，然后在200倍镜下随机选择3个不同的视野计数血管，取其平均值为MVD计数结果。

400倍光镜下统计血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)阳性细胞的百分率，其得分为染色强度与阳性细胞百分比的乘积。选取3个视野取其平均值为VEGF的表达程度。染色强度分级：无染色为0，染色程度弱为1，中等为2，染色程度较强为3。阳性细胞百分比：无阳性细胞为0，0～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，76%～100%为4。

5.统计学分析

表2 VX2骨肿瘤实质区、微观浸润区和单纯水肿区的DKI各参数值比较

结 果

1.模型兔制备结果

成功制备模型兔25只，其中病理切片发现骨肿瘤边界不清、存在微观浸润区者21只，将此21只纳入研究。

2.DKI图像参数分析结果

肿瘤STIR抑脂图像及DKI原始图像见图2。MD值在VX2恶性骨肿瘤实性区、微观浸润区及单纯水肿区中差异有统计学意义(F=44.747，P<0.05)；采用最小显著差异性t检验行多重比较，结果显示肿瘤实性区与微观浸润区(P=0.000)、微观浸润区与水肿区(P=0.000)、实性区与水肿区(P=0.000)的MD值差异均有统计学意义，实性区MD值低于微观浸润区及水肿区，微观浸润区的MD值低于单纯水肿区。MK值在VX2恶性骨肿瘤实性区、微观浸润区及单纯水肿区中差异无统计学意义(F=0.926，P=0.402，表2)。

图2 a)STIR抑脂图像，肿瘤呈外周高、中央稍低信号影；b)b值为0的DKI图像，肿瘤呈高信号；c)b值为1000s/mm2的DKI图像；d)b值为1500s/mm2的DKI图像；e)b值为2000s/mm2的DKI图像。

MD值诊断恶性骨肿瘤实性区与微观浸润区、微观浸润区与单纯水肿区的ROC曲线下面积分别为0.891、0.831(图3)，MD值取1028.5 mm2/s可作为鉴别恶性骨肿瘤微观浸润区与单纯水肿区的的阈值，敏感度和特异度分别为95.24%和66.67%，MD值>1028.5 mm2/s时可考虑为肿瘤的单纯水肿区。

3.病理结果

HE染色示VX2骨肿瘤实性区肿瘤细胞核大、深染，大小不一，排列紧密，核分裂象多，核浆比高，部分呈巢状排列；肿瘤移行区包括微观浸润区和单纯水肿区，其中微观浸润区内可见少量肿瘤细胞呈散在片状分布，而单纯水肿区无肿瘤细胞浸润。CD31染色后血管内皮细胞呈棕褐色着色，与周围组织分界欠清，肿瘤微观浸润区亦见内皮细胞染色；VEGF染色后血管内皮细胞及肿瘤细胞胞浆染色为棕褐色或棕黄色，边界清(图4)。VX2骨肿瘤的水肿区为炎性细胞浸润，无肿瘤细胞，其免疫组化指标为零。CD、MVD、VEGF在肿瘤实性区与微观浸润区中差异均有统计学意义(P值均<0.05)，且3个病理指标鉴别肿瘤实性区与微观浸润区的AUC值均较高，分别为1.000、0.998、0.870(表3)。

表3 肿瘤实质区与微观浸润区的CD、MVD、VEGF值比较

4.病理学与DKI参数的相关性分析结果

肿瘤实性区及微观浸润区的MD值与CD计数均呈显著负相关(r值分别为-0.745、-0.753，P<0.05)，与VEGF计数亦呈负相关(r值分别为-0.726、-0.697，P<0.05)，与MVD之间无明显相关性(r值分别为- 0.356、-0.186，P>0.05)。

图3 a)MD鉴别肿瘤实性区与微观浸润区的ROC曲线；b)MD鉴别微观浸润区与水肿区的ROC曲线。 图4 a)病理图示肿瘤实质区(A)、微观浸润区(B)和单纯水肿区(C)，肿瘤细胞核大、深染，核分裂象多，核浆比高，部分呈巢状排列；微观浸润区散在少量肿瘤细胞呈片状分布；单纯水肿区无肿瘤细胞浸润(×100，HE)； b)CD31染色后血管内皮细胞呈棕褐色着色(×100，CD31)； c) VEGF染色后血管内皮细胞及肿瘤细胞胞浆染色为棕褐色或棕黄色，边界清(×100，VEGF)。

肿瘤实性区及微观浸润区的MK值与CD、MVD、VEGF计数均无统计学相关性(r值分别为0.152、0.108，0.118、008，0.140、0.339，P>0.05)。

讨 论

本研究成功建立兔VX2恶性骨肿瘤模型，模型制备成功率达83.3%(25/30)，肿瘤边界不清、存在微观浸润区者的比例为70%，本研究所有统计学数据均来自存在微观浸润区的骨肿瘤模型。该肿瘤模型是一种同种异体移植性模型，生物学性质稳定、传代简易，且该肿瘤与人类恶性骨肿瘤的生物学行为相似，血供丰富，呈浸润性生长，进行性破坏周围结构，是临床研究恶性肿瘤的理想动物模型[10-12]。赵景新等[12]发现细胞悬液植入法较组织块植入法可提高肿瘤局部浸润率，但后者更易培养出大的瘤体，从而使实验更易于观察。本实验采用传统手术方法将VX2骨肿瘤组织块植入胫骨，瘤体相对较大且存在微观浸润区者的比例也相对较高。

病理学光镜下可区分微观浸润区与单纯水肿区，微观浸润区可见散在的少量肿瘤细胞及炎性细胞，骨髓水肿区内无肿瘤细胞。瘤周水肿的发生机制目前仍不清楚，有文献认为主要包括炎症反应、血管源性水肿、压力淤滞性水肿等[13-14]；肿瘤周围的炎性反应、毛细血管渗出及肿瘤内部压力增高也可导致瘤周水肿，而恶性肿瘤周围水肿主要可能是由于肿瘤浸润或周围组织血流灌注及细胞通透性的改变所引起。

MRI可很好地显示肿瘤周围水肿情况，但常规MRI常难以区分肿瘤周围的微观浸润区与单纯水肿区。相关研究认为，常规T1WI是判断骨肿瘤髓内浸润程度的最佳方法[15-16]，但T1WI显示的肿瘤边界依靠的是骨髓内脂肪替代所显示的肿瘤的所谓边缘，无法显示和区分微观浸润区与单纯水肿区，其显示的肿瘤边缘并不一定是肿瘤在病理意义上的真正确切边缘。本研究制备成功的兔VX2骨肿瘤模型中，MRI常规序列显示肿瘤边界不清，分析其原因可能是模型兔均为未成年兔，骨髓以红骨髓为主，脂肪信号较少，使得骨髓替代的肿瘤区域与正常区域之间在T1WI上缺乏对比而难以区分，而T2WI和STIR抑脂序列在红骨髓和微观浸润区以及单纯水肿区中均显示高信号；另外，VX2瘤株种植成功后可迅速增殖呈浸润性生长，使得骨肿瘤的边界更加难以区分。目前已有研究指出ADC值对区分恶性骨肿瘤微观浸润区与单纯水肿区具有重要价值[17]；DCE-MRI定量参数能准确评估恶性骨肿瘤髓内浸润范围，其中Ktrans值的准确度最高[18]。但目前尚无DKI鉴别骨肿瘤周围水肿与肿瘤浸润的研究报道。

DKI成像目前在中枢神经系统[19-21]、肝脏[22-24]等方面的研究较多，已证实其临床应用价值及研究前景。DWI为常规单e指数模型，假设人体内水分子扩散是不受阻碍的自由运动，水分子在随机运动的情况下其扩散运动位移满足高斯分布即正态分布；而生物组织内水分子的扩散实际上是在细胞间隙、细胞内运动，故运动位移是非高斯分布的。水分子扩散受周围环境的限制程度越大、体素内组织成分越混杂，扩散的非高斯性越显著。DKI是以非高斯模型为基础的一种功能MRI新技术，可提供较常规DWI更精确的组织特征信息，由Jensen等[25]首次提出。MD和MK是DKI模型的两个定量参数，MD是校正后的平均表观扩散系数(ADC)值，代表某一体素内水分子扩散的大小和程度，与组织细胞密度有关，其值越大表明组织内水分子扩散受限程度越小[26]。与ADC值相比，MD值可更好地量化水分子扩散的非高斯行为，从而反映微观结构的细微变化，更接近于水分子在生物组织中的运动和分布[27-28]；MK为平均峰度，其大小取决于感兴趣区内组织的结构复杂程度，组织微观结构越复杂，非正态分布水分子扩散受限越显著，即MK值越大[29]。

肿瘤迅速增殖生长依赖于肿瘤新生血管的形成。恶性肿瘤细胞生长快速，耗氧耗糖增加，导致肿瘤及其周围组织的低氧和低糖状态，从而刺激多种血管生成调节因子如VEGF的分泌[30-31]。VEGF为目前已知的作用最强的促血管生成因子，可诱导内皮细胞产生纤溶酶原激活物、间质胶原酶，增加微血管通透性。目前MVD是评估肿瘤新生血管生成的金标准[32]，MVD计数增高，表明肿瘤新生微血管增生活跃。

本研究Spearman相关性分析结果显示MD值与肿瘤细胞密度(CD)呈负相关，细胞密度越大，MD值越低，这与林浩等[33]在鼻咽癌中的研究结果类似。肿瘤实质区内肿瘤细胞密度较高，微观浸润区内少量肿瘤细胞呈散在分布，水肿区无肿瘤细胞浸润。肿瘤实质区的MD值低于微观浸润区和单纯水肿区，微观浸润区的MD值亦显著低于单纯水肿区，MD值在肿瘤各区域间差异有统计学意义。这是因为DKI对图像信号衰减的拟合优于单指数模型，能更准确地反映病变的异质性[34]。徐阿巧等[35]发现MVD、VEGF在不同子宫肌瘤病理类型间差异有统计学意义。另有研究指出ADC值与宫颈癌MVD值呈负相关[36]，MD值是表观扩散系数的平均值，更可直观准确地反映其与MVD的关系。本研究结果显示MD值与肿瘤实性区及微观浸润区的VEGF表达水平均有一定相关性，但MD值与MVD值相关性不高，本研究与上述文献研究结果存在一定差异，笔者分析原因是VX2肿瘤恶性程度高，肿瘤在其生长过程中微血管生成期、稳定维持期及血管退化各种状态均存在，CD31染色不均一；另外可能与细胞突变、血管内皮细胞异质性较高有关。本研究结果显示，MD值鉴别诊断恶性骨肿瘤实性区与微观浸润区、微观浸润区与单纯水肿区的AUC均大于0.5，在区分肿瘤不同区域方面具有较高的敏感度和特异度。临床工作中对于区分恶性骨肿瘤边界，实际上就是区分微观浸润区与单纯水肿区，DKI图像有助于区分两者，当MD值大于1028.5 mm2/s时，可考虑为骨肿瘤周围单纯水肿区，对临床工作有一定指导意义。

相关研究发现，前列腺良、恶性组织间的MK值差异有统计学意义[37]；王丽芳等[38]研究发现乳腺恶性肿瘤的MK值与Ki-67表达呈正相关。本研究结果表明，MK值在肿瘤实性区、微观浸润区与单纯水肿区之间差异无统计学意义；肿瘤实性区和微观浸润区的MK值与CD、MVD、VEGF计数均无统计学相关性，本研究与上述文献的研究结果不符，分析其原因可能包括两点：①兔VX2骨肿瘤因其生长迅速，肿瘤中央多为坏死，肿瘤细胞环绕于坏死区域周围；②肿瘤DKI图像后处理时，全部感兴趣区由人工勾画，免疫组化指标均由人工计数，可能存在一定误差。

当前DKI参数MD值对骨肿瘤微观浸润区与单纯水肿区的鉴别诊断具有一定研究价值，可作为鉴别两者的联合手段之一，尚无能力单独鉴别，故仍需进一步研究，以提高DKI在骨肿瘤微观浸润区与单纯水肿区诊断中的应用。

综上所述，本研究结果表明DKI参数MD对判断恶性骨肿瘤范围特别是鉴别微观浸润区与单纯水肿区具有较高价值，MD值与肿瘤浸润区的CD、VEGF计数均呈负相关。