全反式维甲酸对肿瘤细胞生长的影响

罗兴永， 董源源， 龙 娟， 童 英

(四川大学生命科学学院生长代谢与衰老研究中心, 成都 610064 )

1 引 言

全反式维甲酸(All-trans-retinoic acid，ATRA) 属于类维甲酸家族成员，是维生素A的活性代谢产物，在细胞增殖、分化、凋亡和胚胎发育中具有重要作用[1].ATRA被认为是第一个肿瘤治疗的靶向药物，在临床上主要用于治疗急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[1].APL是急性髓系白血病的一种独特亚型，表达早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α(PML-RAR-α)癌蛋白，其特征在于纤溶酶产量增加导致严重出血.ATRA通过抑制纤溶酶的产生和降低膜联蛋白A2和S100A100的表达在诱导白血病细胞分化、促进细胞凋亡以及改善出血症状等方面发挥了重要作用[1].ATRA的临床应用将APL从一种高度致命的癌症转化为一种高度可治愈的疾病[2].

由于ATRA在APL中的临床应用取得了巨大的成功，ATRA在治疗多种人类恶性肿瘤方面得到了广泛的研究.然而，APL的遗传和生理病理简单性在人类肿瘤中是相当罕见的，APL因此是目前发现的唯一对ATRA作出有效反应的恶性肿瘤[2].越来越多的研究表明，ATRA可以增强其它化疗药物的抗癌效应：在体外，ATRA与顺铂联合应用可显著抑制肝癌细胞的生长，促进其凋亡[3].ATRA与多西他奇(docetaxel)或泰索帝(taxotere)联合应用可促进前列腺癌和乳腺癌细胞死亡的诱导[4].有机砷化三聚氰胺(Organic arsenical melarsoprol)与ATRA联合使用可明显抑制人乳腺癌和前列腺癌细胞的体外和体内生长[2].ATO(arsenic trioxide)还可与ATRA协同抑制人肝癌、乳腺癌和肺癌细胞的生长和凋亡[2].

受细胞系以及培养条件的影响，不同细胞对特定药物的耐受性不同，在ATRA的使用中发现不同细胞的ATRA有效浓度不同：类维生素A 6-OH-11-O-羟基菲汀(6-OH-11-O-hydroxyphenantrene，IIF)是ATRA的合成衍生物[5].体外研究表明IIF可有效抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡[6].40 μmol/L和80 μmol/L的IIF处理24h可显著诱导SaOS-2细胞凋亡，但对U2OS细胞没有明显效应[7].用5～50 μmol/L的ATRA处理PANC-1细胞1-6 d，可呈剂量/时间依赖性抑制PANC-1细胞生长[8].1～10 μmol/L维甲酸衍生物在多种肿瘤细胞中具有显著的抗肿瘤作用，也有文献报道10倍低浓度(100～500nm的)ATRA可以抑制人髓母细胞(Medulloblastoma ，MB)的增殖[2].但是，一些研究发现吸烟者如果摄入维甲酸会导致肺癌发病率增高[9]，暗示维甲酸可能具有促进肿瘤发生的作用.在五种鳞状细胞癌(squamous cell carcinom，SCC)细胞中，20 nmol/L ATRA可导致细胞数增加30%，而40～100 nmol/L ATRA则可将细胞增殖减少20～30%[10].

硼替佐米(Bortezomib，BTZ，商品名Velcade，PS-341)是用于治疗多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)的临床药物.研究表明BTZ通过可逆地抑制蛋白酶体β5亚基的糜蛋白酶样活性，从而抑制泛素蛋白酶体系统[11]，进而通过各种机制诱导细胞死亡，包括抑制核因子-Kβ的活性，激活p53，积累错折叠蛋白等[11].

不同浓度的ATRA是否会对胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS细胞产生不同的影响还未有研究，因此在本文中我们用浓度跨度较大的ATRA处理这两种细胞.实验结果表明，不同浓度的ATRA对PANC-1和U2OS细胞生长的影响不同，低浓度的ATRA促进PANC-1和U2OS细胞生长，高浓度则抑制其生长.我们还发现，BTZ可以通过凋亡途径促进细胞死亡，ATRA的促生长或抑生长的作用都可被BTZ调控，同时低浓度ATRA与BTZ联合应用会降低凋亡前蛋白Procaspase3的表达，表明联合用药可能影响细胞的凋亡途径.

2 材料与方法

2.1 材 料

2.1.1 实验细胞株 骨肉瘤细胞U2OS和胰腺癌细胞PANC-1购买自CCTCC，保存在四川大学生命科学学院生长代谢衰老研究中心.

2.1.2 主要试剂 ATRA购于sigma公司(R2625)；BTZ购于sigma公司(S1013)；MTS购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清 (FBS)、0.25%胰蛋白酶均购自美国hyclone公司；二甲亚砜(DMSO) 购于Sigma公司；ECL 显影液，PVDF 膜购于Milipore 公司；蛋白分子 Marker购于Fermentas 公司；PMSF购自MERCK公司；蛋白定量试剂盒购自BIO-RAD公司；甘氨酸、SDS购自Amresco公司；APS，TEMED，pH 6.8 Tis-HCl 与pH 8.8 Tis-HCl，脱脂奶粉，10%SDS溶液，30% 丙烯酰胺ACR购于Thermo公司；相关抗体：Actin(Sungene biotech-6G3；1：6000稀释)；Caspase3(CST-9662；1：1000稀释)，羊抗兔IgG购自Santa Cruz Biotechnology.

2.2 方 法

2.2.1 细胞存活率的检测 骨髓瘤细胞U2OS和胰腺癌细胞PANC-1培养于含有10%胎牛血清和1%双抗DMEM高糖培养基中，置于37 ℃，5%CO2的恒温细胞培养箱中培养.当细胞生长至对数期，使用胰酶消化成单细胞悬液，使用台盼蓝染色，细胞计数板计数，96孔板中每孔加入10 000个细胞，37 ℃，5%CO2恒温培养箱孵育12 h，细胞密度为80%左右加入ATRA处理24 h，换液之后每孔加入10 μL的MTS，继续在培养箱中孵育指定时间(U2OS 2 h，PANC-1 3 h)，然后在490 nm波长下检测吸光值.

实验共设置3组：药物实验组(培养基+细胞+药物)，药物对照组(培养基+细胞+DMSO)和空白对照组(培养基)，每个组设置6个重复孔.

细胞存活率的计算：细胞存活率=(药物实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(药物对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)*100%

2.2.2 Western-blotting(WB) 常规方法进行Western杂交.收集细胞沉淀置于冰上，EBC裂解液裂解30 min，期间每间隔10 min漩涡震荡仪震荡30 s然后4 ℃15 000 g离心20 min，将上清移入新EP管并测定蛋白浓度.蛋白样品经12%SDS-PAGE胶电泳，电转至PVDF膜， 5%脱脂牛奶封闭1h，一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗3×10 min，二抗室温孵育1h，TBST漂洗3×10 min.最后经ECL显影液，使用凝胶成像系统进行成像.

2.2.3 数据处理 采用Graphpad prism 6软件进行统计学分析，在结果图中以均数±标准差(mean±SD)表示，实验独立重复至少2次，组间设置6个重复组，以one-way ANOVA统计方法分析组间差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

3 实验结果

3.1 ATRA浓度不同对细胞生长的影响不同

实验中用不同浓度的ATRA(5、10、20、40、80、100、150、200 μmol/L)分别处理PANC-1和U2OS细胞24h，采用MTS法检测ATRA对细胞活力的影响.结果显示，ATRA对PANC-1细胞的生长依据浓度的不同而有不同的效果.在PANC-1细胞中，低浓度(20，40，80，100 μmol/L)的ATRA表现出显著的促进生长的趋势(P<0.001).相反的，高浓度(200 μmol/L)ATRA可明显抑制PANC-1细胞的生长.有趣的是，极低浓度的ATRA(5 μmol/L)则表现出对PANC-1细胞生长的抑制作用(P<0.05)，抑制率为89.50%±0.199(图1A，表1).在U2OS细胞中，我们也观察到类似的现象.低浓度(10，20，40，80 μmol/L)的ATRA可促进细胞的生长，特别是20，40 μmol/L(P<0.01).随着浓度的升高， 150，200 μmol/L的ATRA表现出对U2OS细胞生长的显著抑制作用(P<0.001)(图1B，表1).与PANC-1细胞不同的是，5 μmol/L的ATRA并不能抑制U2OS细胞的生长，这个独特现象暗示PANC-1细胞中可能存在与U2OS细胞不同的ATRA应答方式.

图1 ATRA对PANC-1和U2OS细胞活力的影响

3.2 低浓度ATRA的促生长效应可被BTZ抑制

蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib，BTZ)是常用的一种临床抗癌药物，联合应用BTZ和其它化疗药物显示出较强的抗癌活性.为了检测ATRA和BTZ联合应用对细胞活力的影响，用40 nmol/L的BTZ和40 μmol/L的ATRA联合或单独处理PANC-1细胞或U2OS细胞24h，MTS实验检测细胞活力.结果表明，单独使用40 nmol/L 的BTZ可以明显抑制PANC-1和U2OS细胞的生长(P<0.001)，当联合应用ATRA和BTZ时，细胞活力同样受到明显抑制(P<0.001)(图2，表2).联合用药组和ATRA单独用药组相比有显著差异，而与BTZ单独用药组相比没有显著差异(图2)，这表明40 μmol/L ATRA对细胞生长的促进作用可被40 nmol/L的BTZ抹平，因此，BTZ可以抑制低浓度ATRA的促生长效应.

表1 不同浓度ATRA处理后 PANC-1和U2OS细胞的活力

图2 低浓度ATRA单独或联合BTZ对PANC-1和U2OS细胞活力的影响

表2 低浓度ATRA单独或联合BTZ用药对PANC-1和U2OS细胞活力的影响

3.3 高浓度ATRA抑制细胞生长的能力可被BTZ增强

为进一步检测BTZ对ATRA作用的影响，我们继续进行了高浓度ATRA联合BTZ的用药实验.采用200 μmol/L ATRA和40 nmol/L BTZ单独或联合处理PANC-1或U2OS细胞24 h，MTS实验检测细胞活力.结果显示，高浓度的ATRA可以显著抑制PANC-1和U2OS细胞的生长(P<0.001)，联合应用ATRA和BTZ可明显抑制PANC-1和U2OS细胞的生长(P<0.001)(图3，表3)，与单独应用ATRA相比，联合用药组都具有显著差异(PANC-1,P<0.001;U2OS,P<0.01)；与单独应用BTZ相比，联合用药同样具有显著差异(P<0.01)(图3).

3.4 ATRA和BTZ联合用药可调控凋亡前体蛋白的水平

BTZ能够可逆地抑制蛋白酶体β5亚基的糜蛋白酶样活性，从而抑制泛素蛋白酶体系统以诱导细胞凋亡[20-21].我们的实验结果表明，在U2OS细胞中， BTZ处理可诱导凋亡蛋白的切割以增加活性Caspase3的水平，并且这种作用呈剂量依赖性.40 μmol/L的ATRA并不影响凋亡前体蛋白Procaspase3的含量和切割成熟(图4).而40 μmol/L ATRA与40 nmol/L BTZ联合处理细胞时，虽然并不影响活性Caspase3的水平，却可以明显降低凋亡前体蛋白Procaspase3的表达，表明联合用药有可能通过非Caspase3切割途径影响细胞的凋亡.

图3 高浓度ATRA单独或联合BTZ对PANC-1和U2OS细胞活力的影响

表3 高浓度ATRA单独或联合BTZ对PANC-1和U2OS细胞活力的影响

图4 ATRA和BTZ联合用药可降低凋亡前体蛋白的水平

ATRA作为一种维生素A的活性代谢物，目前在临床上用于治疗急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[1].ATRA通常被认为是一种抗癌化疗药物，对多种肿瘤细胞具有杀伤作用.但随着研究的深入，却发现了一些有趣的现象.一些临床研究表明膳食维甲酸具有促进肿瘤的作用：每天高剂量的β-胡萝卜素可加速DMBA和TPA -诱导的皮肤乳头瘤形成并增加肿瘤的产生[12]；给benzo[a]pyrene-治疗的仓鼠补充高β-胡萝卜素饮食增加了其呼吸道癌的发生率[13]. ATRA衍生物IIF对骨肉瘤细胞和间充质干细胞的生长也呈时间和剂量依赖性，但对U2OS细胞凋亡则没有明显影响[7].与这些结果类似的是，我们的结果表明，在胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS细胞中，ATRA对细胞活力的影响呈现双面效应：低浓度促进细胞生长而高浓度则抑制生长.

与我们的结果不同的是，Guo曾报道5～50 μmol/L的ATRA可抑制PANC-1细胞的生长[8].这种不同可能与应用的培养基有关. Guo的实验采用RPMI-1640培养基，而我们采用的是DMEM培养基.PANC-1细胞在不同培养条件下对ATRA应答方式的不同值得深入研究.

ATRA抑制细胞生长并诱导分化的作用让它在癌症治疗方面获得了广泛的研究，特别是联合用药的探索.5 μmol/L ATRA通过增加肝细胞癌肿瘤起始细胞(HCC TICs)分化，能有效增强肝癌细胞对顺铂(cisplatin)的敏感性[3].5 μmol/L ATRA可增加多西他赛(docetaxel)诱导前列腺癌细胞的凋亡[14].在紫杉醇治疗之前，将乳腺癌细胞与0.01 μmol/L的ATRA孵育3天，可增强紫杉醇诱导的乳腺癌细胞死亡[15]. 0.1、1和10 μmol/L ATRA能强烈增强As2O3诱导的人肝癌、乳腺癌和肺癌细胞生长的抑制并促进细胞凋亡[16].不同的细胞对ATRA的敏感性不同.在本文中我们发现，低浓度的ATRA与BTZ联合应用可以逆转ATRA的促生长效应，高浓度的ATRA与BTZ联合应用可以显著增强ATRA抑制细胞生长的能力，表明在PANC-1和U2OS细胞中，高浓度ATRA和BTZ联合使用才有显著的协同作用，增强细胞对化疗的敏感性，达到更好的治疗效果.