低温环境下水稻种子活力QTL鉴定

姚晓云 ，熊运华，黄永萍，吴延寿，杨 平，刘 进，尹建华*

（1.江西省农业科学院水稻研究所，江西南昌 330200；2.水稻国家工程实验室（南昌）/国家水稻改良中心南昌分中心，江西南昌 330200）

【研究意义】水稻属喜温作物，对低温环境较为敏感。低温冷害导致出苗率低、秧苗生长迟滞，是中高纬度地区水稻生产的常见问题，也是限制水稻高产和稳产的关键因子[1-3]。我国北方稻区芽期、苗期遭遇低温环境常导致发芽率低、幼苗生根少和叶片枯黄，南方稻区早稻育秧遭遇低温（倒春寒）常出现发芽率降低和死苗烂秧，尤其是近年来随着直播稻的盛行，芽期耐冷问题日益凸显[3-6]。利用优异耐冷资源和基因培育抗冷品种是解决冷害问题的最有效途径之一，鉴定新的耐冷优异种质和基因资源对培育耐寒新品种具有重要的理论和现实意义。【前人研究进展】近年来，研究者[7-8]利用不同遗传群体对水稻芽期、苗期、孕穗期和灌浆期耐冷性的生理机制和遗传机理进行了相关研究，相关QTL 分布于12 条染色体上，少数几个QTL 被精细鉴定或克隆。【本研究切入点】诸多研究表明，耐冷性是复杂的数量性状，不同遗传背景下耐冷QTL 存在着较大差异，耐冷特性的遗传及调控机理仍不甚清楚，诸多问题亟待解决，仍需对水稻耐冷特性相关基因分子调控机理进行深入研究[4,9]。此外，研究[10-11]表明，粳稻较之籼稻有较强的耐冷性，而有关籼粳属性量化指标与耐冷性变异的关系研究较少。籼粳属性与芽期、苗期耐冷性呈显著负相关，抽穗期的耐冷指数与籼粳程度无显著相关[4]。徐冲[12]研究表明，不同耐冷性品种籼粳属性存在明显差异，高抗品种籼型基因型较低，低抗品种籼型成分较多。【拟解决的关键问题】本研究利用耐冷型粳稻龙稻5 号和冷敏感的籼稻中优早8 杂交衍生的RIL 群体为试验材料，以低温胁迫下的发芽率为指标评价低温环境下种子活力，探究籼粳属性对芽期耐冷性的影响，以期发掘水稻芽期耐冷的主效QTL。利用耐冷优异基因从根本上提高水稻低温抗性，为培育新的耐冷性品种提供基础种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以耐冷型粳稻龙稻5 号（Longdao5，LD5）和冷敏感籼稻中优早8（Zhongyouzao8，ZYZ8）杂交衍生的重组自交系（recombinant inbred lines，RILs）群体和双亲作为试验材料，RIL群体包含170个株系（F8）。大田试验于2018年江西省农业科学院水稻所试验基地进行，田间管理同当地大田栽培管理。成熟后收取2穴稻穗混合脱粒，常温保存备用。

1.2 耐冷性测定

参考2013—2018年气温记录信息，适时进行自然低温胁迫处理，分别于2019年3月5—26日进行2批低温处理试验，去除偏离值取2 次试验均值统计分析；采用人工气候箱进行低温胁迫处理（白天14 h，15 ℃；夜晚10 h，10 ℃），低温处理10 d。发芽试验前首先进行破除种子休眠处理，42 ℃处理24 h，选取饱满籽粒进行发芽试验；测定自然低温和人工低温胁迫环境下亲本和各株系的发芽率，以低温胁迫下发芽率评价低温环境下种子活力，2次重复，取均值统计分析。

图1 2019年3月江西省南昌县温度情况记录及低温处理日期Fig.1 The temperature in Nanchang County，Jiangxi Province in March 2019，and then the low temperature treatment date

1.3 QTL分析

分子遗传图谱包含223个分子标记，图谱覆盖水稻基因组约1 514.0 cM，标记间平均距离为6.79 cM，平均每对染色体上的标记数为18.58[13]。采用QTL ICI Mapping v4.2的完备区间作图（ICIM）方法[14]进行加性效应、上位互作效应QTL 分析，依据阈值判定QTL 存在与否，并估算QTL 的效应值和贡献率大小。QTL的命名遵循McCouch[15]的原则。

1.4 籼粳属性判定

以亲本为对照，与ZYZ8带型一致的记为II（籼型），与LD5带型一致的记为JJ（粳型），杂合带型记为IJ（杂合型）。根据223个籼粳特异SSR位点的基因型数据计算确定各供试样品的籼型基因频率Fi。

2 结果与分析

2.1 耐冷性分析

不同低温处理下，中优早8 与龙稻5 号的发芽率均存在显著差异；龙稻5 号具有较强耐冷，不同低温胁迫下种子的发芽率显著高于冷敏感品种中优早8（表1）。RIL群体各株系低温胁迫下发芽率存在较大幅度变异，呈现双向超亲分离，近似连续的正态分布（图1）。自然低温和人工低温胁迫处理下的发芽率呈极显著正相关，这表明人工和自然低温胁迫具有较好的重演性；RIL群体属于典型籼粳交群体，各株系呈现籼粳中间类型，耐冷性与籼型成分存在不显著的负相关关系（图2，表2）。

表1 亲本和RILs群体低温发芽率及籼粳基因型分析Tab.1 Distribution of germination rate under low temperature environments for parents and RIL population

图2 亲本和RIL群体低温环境下发芽率及籼粳属性分布情况Fig.2 Distribution of Indica-japonica differentiation，the parents and RIL population GR under low temperature environments

表2 低温胁迫环境下发芽率与籼粳属性相关性分析Tab.2 Correlation coefficients among germination rates under different natural and artificial environments

2.2 不同低温处理条件下耐冷QTL鉴定

自然低温环境下，检测到5 个发芽率相关的QTL，分布于第2、7、8、11 和12 号染色体上，LOD值介于2.40～3.05，解释6.41%～9.41%的表型变异，5 个QTL 表型联合贡献率为41.42%，加性效应为-8.28%～8.81%（表3，图3）。其中qLTGN8表型贡献率和加性效应值均较大，增效等位基因来自ZYZ8，qLTGN7、qLTGN11和qLTGN12增效等位基因来自LD5，具有提高低温胁迫下发芽率的效应。

表3 不同低温环境下水稻耐冷性QTL分析Tab.3 Putative QTL for cold resistance were detected under different low temperature environments

人工低温环境下，检测到5 个控制发芽率相关的QTL，分别位于第3、8、11 和12 号染色体上，LOD值介于2.40～6.58，表型贡献率在3.42%～64.39%。其中qLTGA3效应明显，表型贡献率和效应值均超过20.00%，具有明显的调控低温胁迫环境下的发芽率。第8、11和12 号染色体的耐冷性QTL在不同低温胁迫环境下共性表达，即qLTG8（qLTGN8/qLTGA8）、qLTG11（qLTGN11/qLTGA11b）和qLTG12（qLTGN12/qLT⁃GA12）具有稳定调控不同低温处理环境下发芽率的效应。

图3 不同低温处理条件下发芽率QTL染色体分布Fig.3 Location of QTLs under different low temperature conditions on the genetic map

表4 不同低温环境下水稻发芽率上位性互作分析Tab.4 QTL with epistasis effects for GR under different low temperature environments

2.3 不同低温处理条件下耐冷QTL上位性分析

ICIM-EPI 模型对低温胁迫下发芽率进行上位性效应分析，共检测到17 对上位性互作位点，分布于1～8，11和12号染色体上，LOD值和表型贡献率均值分别为4.43和22.62%，上位性效应介于-21.85～21.62（表4）。位于第1、2、6 和12 染色体上相应的染色体区段对其它区域具有明显的上位性作用，加性效应QTLqLTGN2、qLTG8和qLTGA11a参与上位性互作，其中第2 染色体的加性效应QTLqLTGN2与第4、5、6、7 和11 号染色体相关区段存在明显的上位性效应；位于第12 染色体的QTLqLTG12与第3、6 和8 号染色体上相应区段间存在明显的上位性效应。发芽期耐冷性受多个上位性互作位点调控，互作效应存在于加性效应QTL 间、加性效应QTL 与非加性效应位点间，也可存在于非加性效应位点间，这表明上位性互作效应是调控水稻耐冷特性的重要遗传组成。

3 讨论与结论

近年来，随着水稻轻简化、节本增收栽培方式的推广，直播水稻生产技术变得越来越普遍[16-17]。芽期和苗期低温胁迫是制约直播稻发展的重要非生物逆境因子之一，筛选、利用强耐冷型优异种质和基因资源是解决这一问题的最有效途径[18-19]。不同类型水稻品种的耐寒性存在明显差异，籼稻和粳稻最低的生长适宜温度分别为10 ℃和15 ℃，籼粳形态指数和耐寒性存在明显关系，一般粳稻比籼稻更耐寒[12]。诸多研究者采用不同环境鉴定水稻芽期的耐冷性，利用自然条件鉴定水稻苗期耐冷性可靠性高、实用性强[16,20]。本研究中3月5—27日自然低温处理中日最低温度和平均气温分别在10 ℃和15 ℃左右，形成了较严重的芽期低温冷害，可以准确鉴定水稻芽期耐冷性的强弱，表型性状可反映不同株系自然低温条件下种子活力和发芽能力。研究表明，自然和人工低温胁迫环境下，双亲发芽率均存在极显著差异，龙稻5号的耐冷性均显著强于中优早8；不同株系发芽率存在较大幅度变异，自然与人工低温胁迫下发芽率关系紧密。此外，籼粳属性对不同株系芽期耐冷性强弱存在影响，但相关性未达到显著水平，籼型和粳型株系中均存在强耐冷株系。

水稻芽期耐冷性是一个复杂的数量性状，受品种自身遗传基因、种子大小、处理时期和环境等因素的共同影响[21-23]。目前，研究者利用不同群体和环境已开展了诸多水稻耐冷性相关遗传研究，相关QTL分布于水稻12条染色体上，定位到的QTL相对较多，而精细定位或克隆的QTL较少[8,24]。姜树坤等[9]利用BIL群体在自然低温下对苗期耐冷性进行QTL分析，相关QTL分布于1、3和8号染色体，相关QTL表型贡献率分别为30.8%、22.7%和10.3%；滕胜等[25]对低温发芽率进行QTL分析，检测到2个主效位点qLTG4和qLTG9，其中qLTG4主要作用于发芽后期，qLTG9主要作用于发芽前期；朱金燕等[1]利用CSSL 群体为试验材料，检测到8 个相关位点，其中qCTP9-2表型贡献率超过40%，在不同环境下共性表达，具有明显的遗传效应；周勇等[26]利用CSSL 群体鉴定出23 个芽期耐冷和苗期耐冷性位点，相关QTL 分布于12 条染色体上，位于第9、11和12染色体的QTL 具有较大加性效应，对应代换系耐冷性较强；纪素兰等[27]对水稻种子萌发10 d后低温发芽力进行QTL分析，检测到11个QTL，其中qLTG-7和qLTG-11可在3个环境中稳定表达，最大贡献率均超过25%。本研究检测到10 个控制芽期耐冷性相关的QTL，自然和人工低温胁迫环境下各检测到5 个相关的QTL，分别位于第2、3、7、8、11 和12 号染色体上，主效QTLqLTG8、qLTG11和qLTG12可调控不同低温胁迫环境的发芽率，具有明显遗传效应。本研究还检测到17对上位性互作效应位点，其表型贡献率相对较大，具有明显的遗传效应，因此芽期耐冷性受加性效应QTL 和上位性互作效应共同调控，具有受多基因影响的复杂分子调控机制。与前人研究结果比较表明，表型效应最大的qLT⁃GA3与控制耐低温的qLTG3[28-29]染色体位置相同，稳定表达的qLTG11和qLTG12与qLVG11[10]、qSCT-11[24]，qCTS12[30]、qCT-12[31]所在染色体区域相近，不同遗传群体和环境共性较好；qLTG8是一个新的稳定表达的主效位点。本研究结果为耐冷相关主效位点的精细定位提供依据，也可为水稻芽期耐冷分子育种提供新的基因资源。