施氮量对水稻籽粒脂类合成的影响

涂云彪 ，马 鹏，兰 艳，隋晓东，王 锦，孙影影，龚 静，吴超越，李 天*

（1.四川农业大学农学院，四川成都 611130；2.四川农业大学作物生理生态及栽培四川省重点实验室，四川成都 611130；3.四川农业大学水稻研究所，四川成都 611130）

【研究意义】脂肪是水稻主要的营养物质之一，糙米中的含量最高可达3%以上，精米中约为0.8%左右[1-3]。稻米中构成脂肪的脂肪酸组分多为优质不饱和脂肪酸，具较高的营养价值[4-7]。研究[8-10]表明，稻米脂肪与蒸煮食味品质有着紧密的联系，一般优质稻的脂肪含量高，米饭延伸性高，光泽好，适口性佳。因此，提高稻米脂肪含量是改善稻米品质的有效途径之一。【前人研究进展】稻米脂类的合成及积累不仅受基因的调控，还受生长环境、栽培措施、储藏条件的影响[11-15]。众多研究[14,16-17]一致表明，参与脂肪合成的关键酶（乙酰辅酶A 羧化酶（ACCase）、脂肪酸合酶（FAS）、3-磷酸甘油脱氢酶（3-GPD）和磷脂酸磷酸酯酶（PPase））酶活性均易受栽培和环境条件的影响进而影响脂肪的合成及积累。【本研究切入点】氮肥的施用是生产中提高产量，改善品质最有效的栽培技术之一，当前关于氮肥对稻米脂肪的影响研究颇多，但多集中在对稻米粗脂肪含量、游离脂肪酸含量及脂肪酸组分等表观指标的影响上[18-20]，而关于氮肥对脂类合成过程影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究深入探讨不同施氮量对脂类合成及积累的影响，以期为水稻优质栽培提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验以南粳9108（粳稻）和IR72（籼稻）为材料，于2018—2019年在四川省崇州市桤泉镇四川农业大学现代化农业科研园区进行。供试土壤基础肥力为：pH 5.61、有机质15.50 g/kg、全氮2.54 g/kg、有效磷18.44 mg/kg和速效钾162.40 mg/kg。

本试验采用随机区组设计。设置纯氮0，90，135，180 kg/hm24个施氮水平，分别由N0、N1、N2和N3表示，以N0为对照。小区面积为25 m2（5 m×5 m），设置3次重复，共计24个小区。每小区行穴距为25 cm×20 cm，每穴2 苗。4 月20 日进行水育秧，5 月20 日移栽，秧龄为30 d。各处理施磷肥（P2O5）为72.5 kg/hm2，钾肥（K2O）为135 kg/hm2。氮肥按照m（基肥）∶m（分蘖肥）=7∶3的比例施入，磷、钾肥作为基肥一次性施入。

样品采集：抽穗期，每小区选择同日抽穗的稻穗进行挂牌标记。花后10 d开始采样，每隔5 d取1次，共计6次。每次每小区取20穗，用液氮处理，用于酶活性的测定；另取20穗装袋，用于粗脂肪、脂肪酸组分和游离脂肪酸的测定。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 粗脂肪含量的测定 利用超声波法提取稻米中的脂肪[14]。粉碎去颖壳的稻米，过100 目网筛，称取2 g稻米粉于50 mL离心管中；向离心管中加入20 mL正己烷，摇动1 min，使米粉和正己烷混匀；置于超声波清洗仪中震荡37 min；震荡结束后，转移提取液于新离心管中。重复上述加液-震荡-转移提取液等过程2次，最后1次仅加入10 mL正己烷。将装有提取液的离心管放入7 000 r/min的离心机中离心10 min，转移离心后的上清液于新的离心管中，重复离心3 次。待最后1 次离心结束后，将上清液转移到烘干至恒质量的250 mL 锥形瓶中（m1），并置于90 ℃的水浴锅中蒸馏。待正己烷完全挥发后，将锥形瓶放入80 ℃烘箱中，烘干至恒质量（m2）。计算粗脂肪含量m3=m2-m1。

1.2.2 游离脂肪酸含量的测定 使用超声波法提取脂肪后，用100 mLV（乙醚）∶95%V（乙醇）=1∶1 的混合液溶解脂肪；向锥形瓶内加入2～3滴酚酞指示剂；再用0.1 mol/L 氢氧化钾滴定至粉红色，且1 min 内不退色，记录所用氢氧化钾溶液体积V。按照下面的公式计算游离脂肪酸含量：

式（1）中ω为游离脂肪酸含量，mg/g；V为滴定所用的氢氧化钾体积，mL；C为滴定液氢氧化钾浓度，mol/L；282为油酸摩尔质量，g/moL；m为稻米粉的质量，g。

1.2.3 脂肪酸组分的测定 使用超声波法提取脂肪后，向装有油脂的锥形瓶中加入1 mLV（石油醚）∶V（苯）=1∶1 的混合液溶解油脂，并将其转移到10 mL 离心管中，再量取1 mL 混合液对锥形瓶进行冲洗，冲洗液一并转移到离心管中。向离心管中加入2 mL 0.4 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，摇动1 min，室温下静置10 min，使有机相上浮。用注射器吸取上层液后，经过滤膜，将溶液注入样品瓶内。直接利用美国安捷伦公司生产的Agilent 7890-5975C型气相色谱质谱联用仪进行分析。

1.2.4 脂类代谢相关酶活性测定 3-磷酸甘油脱氢酶（3-GPD）酶活性测定：采用上海通蔚生物科技有限责任公司生产的3-磷酸甘油脱氢酶酶联免疫分析试剂盒测定3-磷酸甘油脱氢酶（3-GPD）酶活性。其操作步骤如下：（1）酶液提取：在冰面去壳，称量1.0 g籽粒于研钵中，加入0.5 g石英砂，冰浴研磨；量取10 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）提取3-GPD 酶1 min。在10 000 r/min 离心机上离心20 min，取上清液用于酶活性测定。（2）酶活性测定：在酶标板上设置1 个空白孔、6 个标准品孔和样品孔，空白孔不加标准品和样品，其他步骤一致。标准品孔加不同浓度的标准品50 µL。待测样品孔加40 µL 稀释液和10 µL样品提取液。除空白孔外，每孔加入100µL 酶标试剂，加完用封口膜封板后，置于37 ℃环境下遮光温育60 min。温育结束，揭开封口膜弃去液体，用稀释20 倍的洗涤液清洗5 次，拍干。向拍干的孔里面先加入50µL 显色剂A 和50µL 显色剂B，震荡混匀，在37 ℃环境下避光显色15 min，最后向每孔里面加入50µL终止液，活性值。

乙酰辅酶A 羧化酶（ACCase）酶活性测定：采用上海通蔚生物科技有限责任公司生产的ACCase酶联免疫分析试剂盒测定ACCase 酶活性。操作步骤同上。脂肪酸合酶（FAS）酶活性测定：采用上海通蔚生物科技有限责任公司生产的FAS酶联免疫分析试剂盒测定FAS酶活性。操作步骤同上。磷脂酸磷酸酯酶（PPase）酶活性测定：采用上海通蔚生物科技有限责任公司生产的PPase 酶联免疫分析试剂盒测定PPase酶活性。操作步骤同上。

2 结果与分析

2.1 施氮量对粗脂肪积累过程的影响

由图1可知，两品种粗脂肪含量随生育进程均呈现单峰曲线变化，南粳9108和IR72分别在花后25 d和30 d 达到峰值。花后各时间段两品种粗脂肪含量均随着施氮量的增加而增加。成熟期（花后35 d）N2、N3处理的南粳9108 粗脂肪含量显著高于N0处理，与N1处理无明显差异；N2、N3处理的IR72 粗脂肪含量显著高于N0、N1处理；表明增施氮肥有利于稻米粗脂肪的积累。

图1 施氮量对水稻籽粒中粗脂肪含量的影响Fig.1 The effect of nitrogen amounts on rice grain crude fat content

2.2 施氮量对游离脂肪酸的影响

由表1可知，两品种游离脂肪酸含量随着施氮量的增加而增加，其中，N2、N3处理的南粳9108游离脂肪酸含量显著高于N0、N1处理，N3处理的IR72的游离脂肪酸含量显著高于其他处理，表明增施氮肥会显著提高稻米中游离脂肪酸的含量。

表1 施氮量对水稻籽粒游离脂肪酸含量的影响Tab.1 The effect of nitrogen amounts application on the content of free fatty acids in rice grain

2.3 施氮量对游离脂肪酸及脂肪酸组分的影响

由表2可知，从南粳9108中检测出11种脂肪酸组分，分别为肉豆蔻酸（C14∶0）、棕榈油酸（C16∶0）、棕榈酸（C16∶0）、亚油酸（C18∶1）、硬脂酸（C18∶0）、二十烯酸（C20∶1）、花生四烯酸（C20∶1）、花生酸（C20∶0）、月桂酸（C12∶0）、山嵛酸（C22∶0）、二十四酸（C24∶0）。从IR72中检测出10种脂肪酸组分，除二十烯酸未检测出外，其他组分与南粳9108相同。从两品种检测出的脂肪酸组分中均以亚油酸、硬脂酸、棕榈酸、花生酸含量最高，这4 种脂肪酸分别占南粳9108 和IR72 总脂肪酸的93.68%和93.03%。根据双键的有无将脂肪酸分为饱和脂肪酸（肉豆蔻酸、棕榈油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、月桂酸、山嵛酸、二十四酸）和不饱和脂肪酸（亚油酸、二十烯酸、花生四烯酸），南粳9108不饱和脂肪酸变幅为65.15%～66.08%，IR72变幅为61.38%～61.97%。

表2 施氮量对水稻籽粒脂肪酸组分的影响Tab.2 The effect of nitrogen amounts on rice grain fatty acid composition%

不同施氮处理下，不同脂肪酸组分均有一定的变化，分析4 种主要脂肪酸含量变化可知，N1处理下，南粳9108亚油酸含量最高，棕榈酸、硬脂酸和花生酸含量最低；N2处理的IR72亚油酸含量最高，棕榈酸、硬脂酸、花生酸含量最低。施氮量对水稻不饱和脂肪酸含量也有明显的影响。N1处理的南粳9108 不饱和脂肪酸含量最高，显著高于N3处理，而与N0、N2处理差异不显著；N2处理的IR72 不饱和脂肪酸含量显著高于其他处理。

2.4 施氮量对脂类合成相关酶活性的影响

2.4.1 施氮量对乙酰辅酶A 羧化酶（ACCase）酶活性的影响 氮肥对稻米籽粒ACCase 酶活性的影响如图2 所示，南粳9108 和IR72ACCase 酶活性随生育期的推进呈先升后降的变化规律。南粳9108 在N0处理条件下ACCase 酶活性在花后20 d 达到峰值，N1、N2和N3处理的ACCase 酶活性在花后25～30 d 达到峰值。IR72 在N0处理下ACCase 酶活性在花后20～25 d 酶活性处于较高水平，N1、N2和N3处理的ACCase 酶活性均在花后25 d 酶活性达到峰值。表明氮肥的施用会推迟ACCase 酶活性到达峰值的时间。各时期的ACCase 酶活性随着施氮量的增加显著提高。N1、N2、N3处理的南粳9108ACCase 平均酶活性分别比对照（N0处理）高32.67%、58.37%和65.86%；N1、N2、N3处理的IR72 ACCase平均酶活性分别比对照（N0处理）高7.99%、27.47%和43.61%。表明在同一施氮处理下，南粳9108 ACCase平均酶活性增幅高于IR72。

图2 施氮量对水稻籽粒乙酰辅酶A羧化酶酶活性的影响Fig.2 The effect of nitrogen on rice grain ACCase activity

2.4.2 施氮量对脂肪酸合酶（FAS）酶活性的影响 施氮量对两品种FAS 酶活性的影响如图3 所示，FAS酶活性随着花后天数的增加，酶活性总体呈现先增后降的变化规律。随着施氮量的增加，两品种FAS酶活性显著提高。N1、N2和N3处理下，南粳9108 FAS 平均酶活性分别比N0处理高56.61%、71.98%和88.90%，N1、N2和N3处理的IR72 FAS 平均酶活性分别比N0处理高22.05%、41.78%和44.83%。表明在同一施氮处理下，南粳9108 FAS平均酶活性增幅高于IR72。

图3 施氮量对水稻籽粒脂肪酸合酶酶活性的影响Fig.3 The effect of nitrogen on rice grain FAS activity

2.4.3 施氮量对乙酰辅酶3-磷酸甘油脱氢酶（3-GPD）酶活性的影响 施氮量对3-GPD 酶活性影响如图4所示，两品种的3-GPD 酶活性变化规律基本一致，均随着花期的推进呈先增后减的变化规律。随着施氮量的增加，两品种3-GPD 酶活性显著提高。N1、N2和N3处理的南粳91083-GPD 平均酶活性分别比N0处理高40.33%、60.38%和78.83%，N1、N2和N3处理的IR723-GPD平均酶活性分别比N0处理高20.31%、45.95%和61.53%。表明在同一施氮处理下，南粳9108 3-GPD平均酶活性增幅高于IR72。

图4 施氮量对水稻籽粒3-磷酸甘油脱氢酶的影响Fig.4 The effect of nitrogen on rice grain 3-GPD activity

2.4.4 施氮量对磷脂酸磷酸酯酶（PPase）酶活性的影响 施氮量对PPase 酶活性的影响如图5 所示，在水稻籽粒发育过程中，两个品种PPase 酶活性总体呈先增后降的变化趋势。随施氮量的增加，两品种PPase 酶活性明显增加。N1、N2、N3处理的南粳9108 PPase 平均酶活性分别比N0处理高41.97%、64.31%和71.12%，N1、N2、N3处理的IR72PPase 平均酶活性分别比N0处理高10.59%、19.87%和26.26%。表明在同一施氮处理下，南粳9108 PPase平均酶活性增幅高于IR72。

图5 施氮量对水稻籽粒磷脂酸磷酸酯酶活性的影响Fig.5 The effect of nitrogen on rice grain PPase activity

3 讨论

3.1 施氮量对粗脂肪含量的影响

稻米中脂肪含量不仅受基因的调控，生长环境、栽培技术及贮藏条件均会影响其含量，其中氮肥会明显影响稻米粗脂肪含量。朱朋波等[15]研究氮、磷、钾肥对稻米粗脂肪含量的影响时发现，氮肥能显著降低糙米中粗脂肪含量。石洪芳等[18]的试验结果表明，在低氮处理（60 kg/hm2）下，高花青色素特种稻粗脂肪含量最高。而顾丹丹[19]研究表明，粳稻在施氮量为180 kg/hm2时，稻米粗脂肪含量最高。水稻脂肪的合成与积累是水稻品种、光照、温度、栽培措施等因素共同影响的结果。因此，造成不同研究者的试验结果出现较大差异可能与水稻生长环境和基因型不同有关。本研究中，南粳9108和IR72粗脂肪积累过程相似，但到达峰值的时间则因品种而异。随着施氮量的增加，两品种花后各时间段稻米粗脂肪含量均明显增加；成熟期（花后35 d），N2、N3处理南粳9108 和IR72 粗脂肪含量明显高于其他处理，表明增施氮肥会显著提高稻米粗脂肪含量。这与施氮量显著提高脂类合成相关酶活性的结论（待报道）一致，即氮肥通过提高水稻脂肪合成相关酶活性，从而加快脂类物质的合成速度，提高粗脂肪在籽粒中的积累。综上，就本研究而言，N2、N3处理更利于粗脂肪的积累。

3.2 施氮量对游离脂肪酸的影响

游离脂肪酸是指未与其他物质结合，单独存在于稻米中的脂肪酸，其含量大小影响着稻米的蒸煮食味品质。前人研究表明，稻米在蒸煮过程中，脂肪酸会与直链淀粉形成直链淀粉-脂肪酸复合物，该复合物能提高稻米的峰值粘度和崩解值，降低消减值，从而提高稻米食味[21]，许光利[14]研究发现提高稻米淀粉脂含量能显著改善稻米食味品质。因此，适当提高稻米游离脂肪酸含量，能改善稻米食味。脂肪酸是三酰甘油、类脂等物质合成的中间产物，其含量的多少是由脂肪酸合成速度与转化成其他物质的速度共同决定。本研究中，增施氮肥能促进游离脂肪酸的积累，这是因为增施氮肥提高了脂肪酸合成的ACCase和FAS 酶活性，加快了脂肪酸合成速度，而成熟期三酰甘油和类脂等物质合成速度减慢，甚至会部分分解成游离脂肪酸，因此游离脂肪酸含量提高。在N3处理下，水稻游离脂肪酸含量最高。

3.3 施氮量对脂肪酸组分的影响

众多研究[4-6]表明，水稻脂肪酸种类丰富，但主要以棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸和花生酸含量最高，其中不饱和脂肪酸含量明显高于饱和脂肪酸含量。本研究中分别从南粳9108 和IR72 中检测出11 种脂肪酸和10 种脂肪酸，均以棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和花生酸等4 种脂肪酸含量最高，其中，不饱和脂肪酸含量明显高于饱和脂肪酸含量。此外，南粳9108 不饱和脂肪酸含量明显高于IR72，表明水稻脂肪酸主要以不饱和脂肪酸为主，且粳稻不饱和脂肪酸含量高于籼稻，这与邢晓燕和回瑞华等[4,6]试验结果相似。

稻米脂肪酸组分受氮肥的影响。李永杰[22]研究表明增施氮肥会显著提高油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的含量。本研究中南粳9108和IR72分别在N1、N2处理下亚油酸含量（不饱和脂肪酸）最高，棕榈酸、花生酸、硬脂酸等饱和脂肪酸含量最低，不饱和脂肪酸总含量高于其他处理，表明氮肥是通过提高亚油酸含量，降低棕榈酸、花生酸、硬脂酸等饱和脂肪酸含量，来提高水稻籽粒中不饱和脂肪酸总含量，且不施氮肥或过量施氮都不利于不饱和脂肪酸的积累，且施氮量对水稻不饱和脂肪酸的影响因品种而异。

3.4 施氮量对脂类合成相关酶活性的影响

在生物体中，脂肪酸和α-磷酸甘油均是脂肪和类脂等合成的直接前体物质，其中脂肪酸是乙酰辅酶A分别在ACCase和FAS两种酶催化下生成，α-磷酸甘油则是磷酸二羟丙酮在3-GPD催化下生成。脂肪酸和α-磷酸甘油则是在PPase等一系列酶催化下生成脂肪和类脂等物质。当前对ACCase、FAS、3-GPD 和PPase这4种酶有不同的研究。ACCase是催化乙酰辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A的关键酶，也是脂肪合成的限速酶，控制着脂肪合成方向的碳流量，其活性的大小与油脂含量呈显著正相关[23-25]。FAS是由7条多肽链构成的多功能复合酶系[26]，其以丙二酸单酰-CoA为原料，催化合成16 C的软脂酸，软脂酸在经过其他酶系的催化下生成16 C及其以上的脂肪酸和不饱和脂肪酸，因此FAS是脂肪合成的必需酶[20]；目前，关于对ACCase 和FAS 研究主要集中在酶结构和调控这两种酶活性的基因上，关于外界环境对ACCase 和FAS的影响少见报道[27-28]。对3-GPD和PPase酶活性研究主要集中在油料作物中，这两种酶活性不仅受基因的调控，还会受生长环境和栽培措施的影响[29-36]。本研究中，增施氮肥会显著提高ACCase、FAS、3-GPD和PPase酶活性，在N3处理下，这4种酶活性最高。结合粗脂肪和游离脂肪酸含量变化可知，氮肥能增加南粳稻9108和IR72的ACCase和FAS酶活性，提高脂肪酸含量；增加3-GPD酶活性，提高α-磷酸甘油的含量；增加PPase酶活性，提高脂肪和类脂等物质的含量。从不品种来看，不论在哪种氮肥水平下，南粳9108中粗脂肪、游离粗脂肪和不饱和脂肪酸含量高于IR72，产生这种差异并不是由氮肥引起的而是由品种本身的基因决定的。各脂肪酸组分是在软脂酸基础上，经延长酶系和去饱和酶系催化下形成的不同链长和不同饱和程度的脂肪酸，因此关于氮肥对脂肪酸组分的影响，还需进一步试验证明。

4 结论

在本实验条件下，在一定范围内（0～180 kg/hm2），随着施氮量的增加，水稻籽粒中ACCase、FAS、3-GPD 和PPase 酶活性显著增大，稻米粗脂肪和游离脂肪酸含量显著提高；表明增施氮肥有利于粗脂肪和游离脂肪酸的积累。南粳9108 和IR72 分别在施氮量为90 kg/hm2和135 kg/hm2处理下，不饱和脂肪酸最高，说明水稻不施氮或过量增施氮肥均不利于提高不饱和脂肪酸的比例，即不利于营养品质的提高，且不同水稻品种的不饱和脂肪酸对施氮量的响应存在差异。综上所述，增施氮肥有利于粗脂肪、游离脂肪酸的积累，而施氮量对水稻不饱和脂肪酸的影响因品种而异。