芸香苷对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的改善作用*

吕晓明 阮淑蒙 宋增美 陈美华

山东第一医科大学(山东省医学科学院)药学院，山东 泰安 271016

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)表现为渐进性的认知能力及记忆力的减退，是发生在老年期的一种常见的中枢神经退行性疾病，其发病隐蔽，早期诊断困难，β-淀粉样蛋白沉积、胆碱能神经元退行性变、Tau-蛋白过度磷酸化等假说是现今AD发病机制较为成熟的假说[1-2]。目前临床用于AD治疗的药物仍然是胆碱酯酶抑制剂，这类药物在一定程度上可减轻AD症状，但是并不能延缓或阻止AD病程的发展，且存在一定的副作用，因此寻找更加安全有效的抗AD药物至关重要。芸香苷是一种从植物中提取的黄酮类化合物，研究表明芸香苷具有抗自由基活性、抗脂质过氧化、抗病毒作用、抗肿瘤作用、抗心血管系统疾病和神经保护等多种功能[3-5]。本研究采用腹腔注射东莨菪碱制备记忆障碍小鼠模型，研究芸香苷对小鼠学习记忆能力的影响，并初步探讨芸香苷改善学习记忆的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

芸香苷，上海源叶生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、乙酰胆碱酯酶(AchE)试剂盒购自南京建成生物工程研究所; Morris水迷宫实验分析系统，上海欣软信息科技有限公司。

1.2 实验动物与分组

实验前1天用Morris水迷宫对小鼠进行筛选，将筛选合格小鼠随机分成5组，正常组，模型组及芸香苷高剂量组(40 mg/kg)、中剂量组(20 mg/kg)和低剂量组(10 mg/kg)，每天同一时间灌胃给药，1次/d，连续14 d。

1.3 东莨菪碱诱导小鼠记忆障碍模型

根据文献[6]制备东莨菪碱致痴呆小鼠模型，Morris水迷宫测试前30 min，模型组、芸香苷药物组(高、中、低剂量)小鼠均腹腔注射1 mg/kg东莨菪碱，正常组小鼠腹腔注射等量生理盐水。

1.4 Morris水迷宫实验[7]

定位航行实验：实验需连续5天，将小鼠依次从4个入水点放入池中，记录逃避潜伏期。60 s内未登上平台的小鼠，逃避潜伏期为60 s。并计算小鼠的平均潜伏期。空间探索实验：在Morris水迷宫实验第6天，将水下平台移去，记录小鼠在目标象限滞留的时间及探索次数。

1.5 脑组织生化指标的测定

行为学实验后，取脑组织，水制备10%匀浆液，4℃、3 000 r/ min，离心10 min，取上清液，测定脑组织SOD活性、MDA含量及AchE活性。

1.6 脑组织HE染色

取脑组织，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，经二甲苯透明，包埋，进行连续冠状切片，常规HE染色，观察脑组织病理形态学变化。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 学习记忆能力测试

定位航行实验中，各组小鼠寻找安全平台的能力随训练次数的增加逐渐提高，平均逃避潜伏期逐步缩短。与正常组相比，模型组小鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.05)。与模型组相比，中剂量组和高剂量组小鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)。见表1。

空间探索实验中，与正常组相比，模型组小鼠在目标象限内探索次数减少，游泳时间缩短(P<0.01)。与模型组相比，高剂量组小鼠在目标象限的探索次数和游泳时间明显增加(P<0.01)，中、低剂量组小鼠的探索次数和游泳时间也增加(P<0.05)。见表2。

2.2 脑组织生化测定

与正常组相比，模型组小鼠脑组织SOD活性降低，MDA含量和AchE活性升高(P<0.05)。芸香苷高、中、低剂量组小鼠脑组织SOD活性升高，MDA含量和AchE活性降低(P<0.05)。见表3。

2.3 脑组织HE染色

HE染色显示，正常组小鼠海马神经细胞数量较多、细胞形态结构正常，排列紧密，细胞质丰富，核仁明显；模型组小鼠海马神经细胞数量减少，细胞形态不规则，核仁不明显；给药组小鼠海马神经细胞排列较整齐，与模型组比较，神经元受损程度降低。见图1。

表1 各组小鼠逃避潜伏期

表2 各组小鼠空间探索实验结果

表3 各组小鼠脑组织中SOD活性、MDA含量及AchE活性

A.正常组；B.模型组；C.高剂量组；D.中剂量组；E.低剂量组。

3 讨 论

阿尔茨海默病是一种起病隐匿，伴有认知障碍和记忆丧失的神经退行性疾病[8]。东莨菪碱诱导的记忆障碍模型是研究AD记忆损害的经典模型，具有简单方便、一致性好的特点，被广泛用于益智药物和抗AD药物的初步筛选。东莨菪碱可阻断M胆碱受体，抑制脑内胆碱能信号功能，从而干扰学习获得和短期记忆的过程[9]。Morris 水迷宫是一种检测啮齿类动物空间学习能力的最常用的测试方法，Morris 水迷宫实验中，模型组寻找平台时间明显延长，空间探索实验中穿台次数和在目标象限游泳时间降低；芸香苷可增加小鼠的穿台次数和延长目标象限的游泳时间，说明芸香苷可以改善小鼠的学习记忆能力。

Ach是脑内重要的神经递质，对认知和学习记忆能力具有重要的调节作用，AD患者脑内Ach减少是造成学习记忆损害的重要而直接的原因[10-11]。乙酰胆碱酯酶抑制剂抑制AchE,增加突触间隙Ach含量，可改善AD患者的认知障碍，乙酰胆碱酯酶抑制剂仍然是目前治疗AD的有效药物[12]。本实验中，芸香苷可降低AchE活性，减少Ach的水解，通过降低AchE活性而增强脑内的胆碱能神经功能。

脑组织脂质含量丰富，耗氧量高，容易受到氧自由基的损伤，广泛的氧化应激是是AD病理进程中最早发生的事件[13]。过量生成的活性氧自由基(ROS)易使机体受到氧化损伤，研究表明，氧化应激与认知功能障碍之间存在明显的相关性，在减少ROS药物提高学习能力、改善记忆缺陷方面具有一定作用[14]。SOD活性、MDA含量可以综合评价氧化应激水平，SOD可有效清除体内ROS,其活性可反映机体的抗氧化能力，MDA是衡量机体细胞膜氧化损伤的重要标志，也有报道MDA异常增加与记忆损伤有一定的联系[15-16]。本研究显示，芸香苷能提高SOD活性，降低MDA含量，说明其神经保护作用与抗氧化作用密切相关。

综上所述，芸香苷对东莨菪碱诱导小鼠记忆障碍有明显的保护作用，其机制涉及抗氧化和影响胆碱能神经的活性。