微管相关蛋白4对肺腺癌 A549细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡的影响

高标，马凡尼，李相磊

1开封市中心医院医学检验科，河南 开封 475000

2河南大学淮河医院检验科，河南 开封 475007

微管相关蛋白4（microtubule-associated protein 4，MAP4）可表达于除神经外的全身组织，其主要作用是调节细胞周期和稳定微管[1]。研究表明，MAP4可影响食管鳞状细胞癌细胞的侵袭能力，进而影响患者预后[2]。另有研究表明，MAP4与膀胱癌细胞的迁移和侵袭有关[3]。肺腺癌是一种非小细胞肺癌，常发生于女性及不抽烟者中[4]。大部分肺腺癌起源于支气管黏膜上皮，少数起源于大支气管黏液腺[5]。在所有类型的肺癌中，肺腺癌的发病率较低，发病年龄相对较小，早期肺腺癌无明显的临床症状，肿瘤生长较为缓慢[6]。肺腺癌的侵袭和迁移是一个涉及多个基因的复杂过程，目前肺腺癌发生发展的分子机制尚未完全研究清楚。本研究探讨了MAP4对肺腺癌细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡的影响，旨在为研究肺腺癌发生发展的分子机制提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年8月至2020年8月开封市中心医院收治的肺腺癌患者。纳入标准：①经病理检查确诊为肺腺癌；②初诊患者；③术前未接受放化疗。排除标准：病历资料不完整。依据纳入和排除标准，本研究纳入66例患者。其中，男51例，女15例；年龄24～80岁；有吸烟史48例；中高分化45例，低分化21例；有淋巴结转移39例。收集肺腺癌患者的肺腺癌组织标本66例和癌旁组织标本57例。

1.2 细胞、试剂与仪器

人肺腺癌细胞株A549购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM、胎牛血清培养基均购自美国Hyclone公司，青霉素、链霉素、胰蛋白酶细胞消化液均购自美国Gibco公司，细胞冻存液、脂质体3000试剂盒均购自美国Invitrogen公司，BCA蛋白定量试剂盒、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、HRP标记的羊抗兔IgG、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、蛋白提取试剂盒、CCK-8细胞增殖检测试剂盒均购自上海睿安生物科技有限公司，MAP4抗体购自英国Abcam公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。CO2培养箱、台式低温高速离心机、酶标仪均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，倒置显微镜购自德国Leica公司，显微成像系统购自日本Nikon公司，UV2000分光光度计购自美国UNICO公司，凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.3 免疫组织化学染色法检测MAP 4蛋白的表达情况及结果判定

将固定好的组织标本脱蜡至水，于抗原修复液中浸泡10 min煮沸，自然冷却后采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，滴加3%过氧化氢溶液孵育10 min，PBS冲洗3次，血清封闭10 min，弃血清，一抗4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，二抗室温孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木素复染，镜下观察。细胞质被染为棕黄色或棕褐色视为阳性。采用半定量法进行评分，阳性细胞百分比评分：阳性细胞百分比＜25%为0分，25%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分；染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项评分相加，0～3分为阴性，其余为阳性。

1.4 细胞培养及转染

采用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基培养A549细胞，于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3天传代1次，待细胞生长密度超过80%时，采用胰蛋白酶消化，离心弃上清，采用细胞冻存液重悬，转至无菌管中，保存于-80℃。向细胞中分别转染siRNA-NC质粒和siRNA-MAP4质粒作为siNC组和siMAP4组，操作步骤依据脂质体3000试剂盒说明书进行。

1.5 蛋白质印迹法（Westernblot）检测MAP 4蛋白表达

依据蛋白提取试剂盒说明书提取细胞中的蛋白质，采用BCA法测定蛋白浓度，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），然后转膜，于室温下采用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2 h，采用MAP4一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min，采用HRP标记的二抗于室温下孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min，采用ECL试剂盒进行化学发光显影，按照说明书进行操作，采用凝胶成像系统采集图像，采用BandScan 4.0软件分析条带灰度。

1.6 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力

将细胞接种于6孔板，培养24 h形成单层细胞，采用无菌枪头进行均匀的“一”字划痕，洗去漂浮细胞，更换培养基，继续培养细胞，于显微镜下观察24 h和48 h的细胞迁移情况。

1.7 Transwell实验检测细胞的侵袭能力

采用无血清培养基将细胞饥饿培养6 h，将Matrigel胶按1∶4的比例稀释，在Transwell上室中加入40 μl，均匀覆盖，孵育2 h，消化后离心收集细胞，调整细胞密度至 5×105/ml，将 200 μl细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室中加入500 μl培养基，培养24～48 h，采用棉签擦去小室上层的基质胶及内层细胞，将小室取出后，倒置风干，采用95%乙醇固定5 min，向24孔板中加入500 μl的1%结晶紫溶液，置入小室，浸膜于其中，室温放置5 min后取出，PBS清洗后置于载玻片上，封片，显微镜下计数。

1.8 CCK- 8法检测细胞的增殖能力

将转染后的A549细胞培养至对数生长期，收集细胞并计数，调节细胞密度至2×104/ml，吸取100 μl细胞悬液至96孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，每孔加入10 μl CCK-8溶液，混合均匀后，37℃孵育2 h，采用酶标仪测定450 nm处的光密度（optical density，OD）值。

1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡

采用膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘 化丙啶（propidium iodide，PI）双染色法检测细胞凋亡情况，收集转染后的A549细胞进行重悬，将细胞密度调整至 1×106/ml，将100 μl细胞悬液转至 5 ml流式管中，加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混匀后室温避光孵育15 min，加入400 μl缓冲液，采用流式细胞仪进行检测。

1.10 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织和癌旁组织中MAP 4表达情况的比较

肺腺癌组织中MAP4的阳性表达率为56.06%（37/66），明显高于癌旁组织的19.30%（11/57），差异有统计学意义（χ2=17.371，P＜0.01）。（图1）

图1 肺腺癌组织和癌旁组织中MAP 4的表达情况（免疫组织化学染色，×400）

2.2 两组肺腺癌细胞中MAP 4相对表达量的比较

siMAP4组肺腺癌细胞中MAP4的相对表达量为（0.29±0.08），低于siNC组肺腺癌细胞的（0.60±0.12），差异有统计学意义（t=3.723，P＜0.05）。（图 2）

图2 Western blot检测两组肺腺癌细胞中MAP 4的表达情况

2.3 两组肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的比较

siMAP4组肺腺癌细胞的24 h和48 h未迁移区域分别为（78.25±10.02）%和（62.47±7.26）%，分别明显高于siNC组肺腺癌细胞的（43.56±8.31）%和（31.32±4.54）%，差异均有统计学意义（t=4.616、4.889，P＜0.01）。siMAP4组肺腺癌细胞的侵袭细胞数目为（102±5）个，明显少于siNC组肺腺癌细胞的（210±11）个，差异有统计学意义（t=15.481，P＜0.01）。（图3、图4）

图3 细胞划痕实验检测两组肺腺癌细胞的迁移能力

图4 Transwell实验检测两组肺腺癌细胞的侵袭能力（结晶紫染色，×400）

2.4 两组肺腺癌细胞增殖能力的比较

转染后1～5天，siMAP4组肺腺癌细胞的OD450值与同时间点siNC组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 转染后 1～ 5天两组肺腺癌细胞的OD450值（±s）

表1 转染后 1～ 5天两组肺腺癌细胞的OD450值（±s）

时间第1天第2天第3天第4天第5天1.93±0.12 3.56±0.37 4.41±0.32 4.22±0.21 4.19±0.19 1.92±0.11 3.43±0.28 4.27±0.33 4.20±0.23 4.03±0.25 siNC组siMAP4组

2.5 两组肺腺癌细胞凋亡情况的比较

siMAP4组肺腺癌细胞的凋亡率为（34.82±7.65）%，与siNC组肺腺癌细胞的（39.27±8.34）%比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图5）

3 讨论

图5 Annexin V-FITC/PI 双染色法检测两组肺腺癌细胞的凋亡情况

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类健康[7]。非小细胞肺癌占全部肺癌的80%，其中最常见的是肺腺癌[8]。肺腺癌生长较慢，但具有较高的浸润性和破坏性，并且极易出现血行转移和淋巴结转移[9]。远处转移和局部复发是肺腺癌患者最主要的死亡原因[10]。近年来随着医疗技术和理念的进步，肿瘤的分子靶向治疗得到越来越广泛的应用[11]。MAP4属于微管相关蛋白（microtubule-associated protein，MAP）家族成员，首先发现于小鼠神经母细胞瘤细胞，对装配、稳定微管具有重要作用[12]。研究表明，下调MAP4的表达可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高化疗效果[13]。另有研究发现，肺癌组织中MAP4mRNA与stathminmRNA的比值高于正常肺组织，说明MAP4对诊断肺癌具有指示作用[14]。

微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，是构成细胞骨架的重要成分之一[15]。微管的功能主要受MAP的调节，在细胞收缩、运动及物质运输中具有重要作用[16]。由于MAP4可提高微管强度、聚集微管，而微管在细胞分裂和细胞运动过程中又具有至关重要的作用，因此MAP4可能与肿瘤细胞的迁移和侵袭具有一定关联[17]。研究报道，MAP4水平是检查前列腺癌及判断前列腺恶性肿瘤侵袭性的潜在指标[18]。还有研究证实，MAP4与口腔鳞状细胞癌的恶性生物学行为相关[19]。本研究检测了肺腺癌组织和癌旁组织中MAP4的表达情况，结果发现，肺腺癌组织中MAP4的阳性表达率明显高于癌旁组织，提示MAP4高表达可能与肺腺癌的发生发展有关。

肺腺癌的迁移和侵袭是一个较为复杂的过程，与多种原癌基因及抑癌基因相关[20]。本研究通过RNA干扰技术调节肺腺癌细胞A549中MAP4的表达水平，结果显示，下调MAP4的表达可抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭。这可能是由于MAP4具有调节微管的作用，MAP4水平降低导致微管强度减弱，进而引起肿瘤细胞的分裂和运动能力降低，迁移和侵袭能力受到抑制。CCK-8和流式细胞仪检测结果显示，MAP4表达水平对肺腺癌细胞的增殖和凋亡无显著影响，这可能是因为MAP4不参与A549细胞增殖和凋亡相关信号通路的激活。

综上所述，MAP4在肺腺癌组织中高表达，MAP4高表达可提高肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力，在肺腺癌的发生发展中具有重要作用，本研究暂未发现MAP4对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响，但具体机制还有待更深入的研究。