喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let- 7 a的表达及临床意义

侯俊胜，豆彪，陶学勇，翟性友

1河南大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，河南 开封 475000

2解放军总医院海南医院耳鼻咽喉头颈外科，海南 三亚572013

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的5.7%～7.6%。近年来，尽管以手术为主的综合治疗方案使喉癌患者预后得到改善，但其远期生存率并未见明显提高，尤其是伴颈部淋巴结转移患者，其5年生存率不足50%[1-2]。阐明喉癌发生发展的分子机制，探寻分子靶向标志物以实现靶向治疗是提高喉癌患者生存率的关键。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年发现的非编码内源性小分子RNA，对基因表达进行转录后的负向调控，研究显示，miRNA与多种恶性肿瘤的发生发展紧密关联[3-5]。miRNA-384在多种恶性肿瘤中存在明显异常表达，被认为是一种抑癌miRNA，能够抑制肿瘤的侵袭、转移[6-7]。miRNA-let-7a在肝癌、前列腺癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中表达下调，也是一种抑癌miRNA，可通过作用于高迁移率族蛋白而发挥抗肿瘤作用[8-9]。但在喉癌中，miRNA-384、miRNA-let-7a表达是否对肿瘤侵袭、转移有影响，目前尚缺乏相关报道。为此，本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let-7a的表达水平，分析其与患者临床特征的关系，探讨其对预后的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年6月至2014年6月在河南大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科经手术病理证实的喉癌患者的病历资料。所有患者均具有完整病历资料及随访资料，术前均未接受放化疗及免疫治疗，且均采集喉癌组织及癌旁正常组织（距肿瘤组织0.5～1.0 cm）标本。共纳入80例喉癌患者，其中，男72例，女8例；年龄36～83岁，中位年龄59岁；病理类型均为喉鳞状细胞癌，高分化癌48例，中分化癌28例，低分化癌4例；原发部位：声门上型18例，声门型52例，声门下型10例；淋巴结转移22例，无淋巴结转移58例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期31例，Ⅳ期17例。全部标本均于手术切取离体后置入液氮中，转运至-80℃冰箱中保存。

1.2 仪器与试剂

荧光定量PCR仪购自美国Thermo Forma公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国Applied Biosystems公司；PCR引物由南京金斯瑞公司设计合成；-80℃低温冰箱购自无锡冠亚恒温制冷技术有限公司。

1.3 检测方法

总RNA的提取：①组织匀浆。取组织标本约100 mg，放置到EP管中，加入Trizol试剂1 ml，冰上操作匀浆至液态。静置5 min后，4℃环境下离心（12 500 r/min，5 min）。②两相分离。吸取1.5 ml组织上清液到新的离心管（1.5 ml）中，加入200 μl氯仿，轻轻振荡EP管，混匀，EP管液体为粉红色乳状，室温静置5 min，4℃离心（12 000 r/min，15 min），此时液体分为3层，其中RNA全部溶解于上层水相。③RNA沉淀。取离心后的上层水相，移至新的EP管（1.5 ml）中，加入异丙醇，充分混匀，静置10 min，4℃环境下离心（12 000 r/min，10 min）。④RNA洗涤。吸除上清液，可见EP管底部沉淀有白色物质，加入1 ml无水冰乙醇，轻弹EP管底部使白色沉淀物充分洗涤，振荡，4℃环境下离心（12 000 r/min，15 min）。离心后肉眼可见EP管底部存在少量白色沉淀物质，将上清液弃掉，将EP管置于超净台中20 min，使RNA干燥。⑤RNA沉淀重新溶解。采用移液枪往RNA沉淀中加入RNA-free H2O，反复吹打数次，于55～60℃下孵育10 min。取2 μl溶解液进行RNA测定，将得到的RNA溶解液置于-80℃环境下保存。

qRT-PCR检测喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let-7a的表达：采用qRT-PCR法，以两步法检测miRNA-384、miRNA-let-7a表达量，按逆转录试剂盒说明进行反转录反应。应用通用的反转录条件转录目的miRNA，95℃ 30 s、95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，共40个循环。以U6为内参，以2-ΔCt表示miRNA-384、miRNA-let-7a的相对表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用方差分析，两组比较采用两独立样本t检验；相关性分析采用Pearson相关系数法；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌组织与癌旁正常组织中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相对表达量的比较

喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let-7a相对表达量均明显低于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 喉癌组织与癌旁正常组织中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相对表达量的比较（±s）

组织喉癌组织（n=80）癌旁正常组织（n=80）t值P值0.56±0.18 1.37±0.39 16.867 0.000 0.51±0.16 2.36±0.58 27.502 0.000 miRNA-384miRNA-let-7a

2.2 喉癌组织中miRNA-384与miRNA-let- 7 a表达的相关性分析

Pearson相关性分析显示，喉癌组织中miRNA-384相对表达量与miRNA-let-7a相对表达量呈正相关（r=0.457，P＜0.05）。

2.3 不同临床特征的喉癌患者的喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let- 7 a相对表达量的比较

临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的喉癌患者的喉癌组织中miRNA-384相对表达量分别明显高于临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（t=4.738、3.567，P＜0.01）；临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的喉癌患者的喉癌组织中miRNA-let-7a相对表达量分别明显高于临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（t=3.445、2.991，P＜0.01）。不同性别、年龄、肿瘤直径、原发部位、分化程度及有无吸烟史喉癌患者的喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let-7a相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征的喉癌患者的喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let- 7 a的相对表达量（ n=80）

2.4 生存分析

随访截至2019年10月，中位随访时间39个月（5～60个月）。根据喉癌组织中miRNA-384、miRNA-let-7a相对表达量中位数，定义miRNA-384 0.46为低表达（n=35），＞0.46为高表达（n=45）；并定义miRNA-let-7a≤0.42为低表达（n=31），＞0.42为高表达（n=49）。miRNA-384高表达患者术后5年生存率为84.3%，明显高于低表达患者的66.2%；miRNA-let-7a高表达患者术后5年生存率为82.9%，明显高于低表达患者的64.8%，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（图1、图2）

3 讨论

局部复发及颈部淋巴结转移是限制喉癌治疗效果进一步提高的瓶颈。目前，喉癌的病因仍未完全明确，如何在分子水平阐明其发生发展的分子机制，探寻新的靶向治疗方法是临床研究之热点。

图1 miRNA-384高表达（ n=45）与miRNA-384低表达（ n=35）喉癌患者的生存曲线

图2 miRNA-let- 7 a高表达（ n=49）与miRNA-let- 7 a低表达（ n=31）喉癌患者的生存曲线

miRNA是一类真核生物内源性非编码单链的小RNA分子，长19～23个核苷酸。研究表明，尽管miRNA在人体基因数中仅占2%，却对30%以上的人体基因表达有着调控作用，介导细胞生长、分化及凋亡等多种生物学过程，与多种疾病的发生、进展紧密关联[10-11]。miRNA-384被认为是一种肿瘤抑制因子。目前，已在多种肿瘤中发现，miRNA-384表达与肿瘤发生发展密切相关。Chen等[12]研究发现，lncRNA CRNDE通过抑制miRNA-384表达而促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭，提示miRNA-384参与了肝癌的发生发展。Zhang等[13]研究显示，miRNA-384能够靶向抑制AKT3表达而抑制大肠癌细胞增殖。研究认为，miRNA-384是潜在的抑癌因子，在多种致癌信号通路中发挥着重要的调节作用[14]。且已有研究显示，喉癌组织中miRNA-384表达明显降低[15]。本研究显示，与癌旁正常组织相比，喉癌组织中miRNA-384相对表达量明显降低，且临床分期越晚、伴淋巴结转移患者的喉癌组织中miRNA-384相对表达量相对越低，提示miRNA-384表达下调与喉癌发生、侵袭及转移密切相关。

miRNA-let-7a作为较早被发现的miRNA家族重要成员，可通过与靶mRNA进行互补配对，抑制蛋白翻译过程，对内源蛋白表达产生调节作用，进而参与基因调控[16]。在胚胎期组织中，miRNA-let-7a表达较少，而在分化成熟的组织中，其表达逐渐增多。有研究提示，miRNA-let-7a也可能是一种抑癌因子，在一系列致癌信号通路中发挥着重要的调节作用[17]。miRNA-let-7a被发现在多种恶性肿瘤组织中呈低表达，其低表达与肿瘤发生、发展呈正相关，且低表达miRNA-let-7a的癌症患者生存率较低[18]。众多证据表明，miRNA-let-7a在恶性肿瘤中有着强大的抑癌基因功能。Tang等[19]研究显示，miRNA-let-7a可通过抑制丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）表达而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Guo等[20]也发现，miRNA-let-7a可通过下调PKM2表达而抑制宫颈癌的发生发展。Liu等[21]研究表明，miRNA-let-7a可通过介导高迁移率族蛋白A2（high-mobility group protein A2，HMGA2）表达，而对食管癌细胞增殖、迁移产生抑制作用。本研究应用qRT-PCR对喉癌组织及癌旁正常组织中miRNA-let-7a表达水平进行检测发现，miRNA-let-7a在喉癌组织中表达明显降低，且晚期、有淋巴结转移患者的喉癌组织中miRNA-let-7a相对表达量分别明显低于早期、无淋巴结转移患者，提示miRNA-let-7a表达下调，可能参与了喉癌的发生发展，这可能是喉癌发生的重要分子机制，有望成为靶向治疗的新靶点。本研究对miRNA-384与miRNA-let-7a的相对表达量进行相关性分析显示，二者呈正相关，二者表达下调可能共同促进了喉癌的发生发展。此外，本研究还对患者5年生存情况与这两种基因表达之间的关系进行了分析，结果显示，miRNA-384高表达患者术后5年生存率为84.3%，明显高于低表达患者的66.2%；miRNA-let-7a高表达患者术后5年生存率为82.9%，明显高于低表达患者的64.8%；提示miRNA-384、miRNA-let-7a高表达有利于患者预后。由此推测miRNA-384与miRNA-let-7a可作为判断喉癌病理进程及预后的新型分子标志物。综上所述，本研究显示，miRNA-384、miRNA-let-7a在喉癌组织中均呈低表达，与肿瘤发生、侵袭、转移及预后密切相关，这将有助于深入研究喉癌的发病机制，并为临床诊疗提供更多策略及思路。