长链非编码RNA富核转录本 1和INK 4位点反义非编码RNA在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床价值

周天磊，陈萍#，唐玲玲，汪毅

江苏大学附属医院1呼吸内科，2中心实验室，江苏 镇江 212001

胸腔积液是由各种疾病引起的常见并发症，恶性疾病是胸腔积液的主要原因之一，约有2/3的恶性胸腔积液由肺癌、乳腺癌、淋巴瘤导致[1]。恶性胸腔积液的存在通常提示疾病已处于晚期，正确的诊断对进一步的治疗至关重要，因此，新的肿瘤标志物用于良恶性胸腔积液的鉴别诊断成为了研究的热点。研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在肿瘤细胞的发生、发展中扮演着重要的角色[2]。研究显示，长链非编码RNA富核转录本1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中呈高表达，并且参与了肿瘤细胞的增殖、浸润、转移及凋亡[3-4]。INK4位点反义非编码RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）也有类似的报道，研究表明，ANRIL在肺癌和乳腺癌组织中的表达水平高于正常肺组织和乳腺组织，且促进了肺癌组织对顺铂的耐药，并被认为可以作为肿瘤预后判断的指标以及治疗的靶点[5-7]。然而，NEAT1和ANRIL在良恶性胸腔积液中的表达水平尚不清楚。因此，本研究以良恶性胸腔积液患者作为研究对象，采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测NEAT1与ANRIL在胸腔积液中的相对表达量，探讨其在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2017年7月至2019年7月江苏大学附属医院收治的100例胸腔积液患者。纳入标准：①首次就诊的胸腔积液患者；②良性胸腔积液患者的原发病灶均可通过临床表现、体格检查、实验室检查及影像学特征明确诊断；③恶性胸腔积液患者的原发病灶均可通过组织病理学或细胞学检查明确诊断。排除标准：标本收集前患者采用过药物治疗。100例患者中，良性和恶性胸腔积液患者均为50例。良性胸腔积液患者中，男32例，女18例；年龄20～83岁，平均（63.30±14.08）岁；炎性胸腔积液17例，结核性胸腔积液27例，心功能不全、乳糜性胸腔积液、低蛋白血症各2例。恶性胸腔积液患者中，男 28例，女 22例；年龄 41～86岁，平均（69.63±12.01）岁；肺癌41例（肺腺癌32例，肺鳞状细胞癌6例，小细胞肺癌3例），卵巢癌2例，胃癌2例，恶性淋巴瘤2例，前纵隔B型胸腺瘤、前列腺癌及食管癌各1例。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者及家属均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器

Trizol试剂、PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成；QuantStudio®5实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，MyCycler PCR仪购自美国Bio-Rad公司，Micro21R高速冷冻离心机购自美国Thermo公司，Colibri超微量分光光度计购自德国Berthold Detection Systems公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胸腔积液处理 收集患者的胸腔积液标本200 ml，采用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，30 min内进行如下处理：①将200 ml胸腔积液标本分装于50 ml离心管内，4℃条件下1060 r/min离心5 min，弃上清留沉淀；②向沉淀中加入3000 μl红细胞裂解剂，吹打混匀，并于4℃条件下520 r/min离心5 min，弃上清留沉淀；③加入3000 μl磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），吹打混匀，充分洗涤沉淀，继续于4℃条件下1060 r/min离心5 min，弃上清；④重复②③步骤各1次，取沉淀加入1 ml Trizol液，吹打混匀后于-80℃冻存备用。同时留取10 ml胸腔积液标本进行癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）测定。

1.3.2 RNA提取 ①将上述处理后的标本常温解冻，取500 μl，加入100 μl氯仿，充分振荡，静置5 min后，4℃条件下12 275 r/min离心15 min；②吸取上清液200 μl，加入等量异丙醇，上下颠倒后于室温下静置10 min，然后于4℃条件下12 275 r/min离心10 min，弃上清留沉淀；③向沉淀中加入500 μl 75%乙醇，充分振荡洗涤沉淀，并于4℃条件下7970 r/min离心5 min，弃上清留沉淀，重复洗涤两次；④将沉淀置于室温下干燥至无色透明，加入100 μl焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水充分溶解；⑤测定RNA的纯度及浓度，D260nm/D280nm在1.8～2.0之间，浓度在300～500 ng/μl之间视为可用标本。

1.3.3 逆转录 根据PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒说明书，于冰上配制逆转录反应液，RNA溶液和逆转录试剂总体积为20 μl。逆转录条件：37℃5 s，85℃15 min，4℃保存。合成的cDNA随即可进行实时荧光定量PCR，也可置于-20℃冷冻备用。

1.3.4 实时荧光定量PCR 根据SYBR®Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒说明书，于冰上配制PCR反应液，cDNA溶液和相应的PCR试剂总体积为20 μl。PCR反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃5 s，退火和延伸60℃34 s，共40个循环。选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参基因。每个标本的两个目的基因（NEAT1和ANRIL）和内参基因重复测定3次，记录Ct值，3次测定的Ct值相差小于0.005视为可用Ct值，取均值。采用2-Ct法计算各个目的基因的相对表达量。所有基因的引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。GAPDH上游引物为5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物为5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；NEAT1上游引物为 5'-TCCTTGCCTCCACTCCAATCCAG-3'，下游引物为5'-GCACTGCCATCAACACCTCCTG-3'；ANRIL上游引物为5'-AGCAGACATTGGAGTGAACGCATC-3'，下游引物为5'-TTGACTGGACCTGGTGGCTACG-3'。

1.4 观察指标

以病理诊断结果为金标准，分析NEAT1、ANRIL和CEA对恶性胸腔积液的诊断效能。灵敏度=真阳性例数（/真阳性+假阴性）例数×100%，特异度=真阴性例数（/真阴性+假阳性）例数×100%，阳性预测值=真阳性例数（/真阳性+假阳性）例数×100%，阴性预测值=真阴性例数（/真阴性+假阴性）例数×100%，准确度=（真阳性+真阴性）例数/总例数×100%。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验或近似t检验。根据NEAT1和ANRIL基因的相对表达量，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，获取曲线下面积（area under the curve，AUC），依此确定临界（cut-off）值，并通过计算灵敏度、特异度等指标评估两种lncRNA对恶性胸腔积液的诊断效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 良恶性胸腔积液中NEAT 1和ANRIL相对表达量的比较

良性胸腔积液中NEAT1的相对表达量为（0.020±0.013），明显低于恶性胸腔积液的（0.075±0.047），差异有统计学意义（t=6.073，P＜0.01）。良性胸腔积液中ANRIL的相对表达量为（0.001±0.001），明显低于恶性胸腔积液的（0.004±0.005），差异有统计学意义（t=3.463，P＜0.01）。

2.2 NEAT 1、ANRIL和CEA诊断恶性胸腔积液的ROC曲线

ROC曲线分析结果显示，NEAT1和ANRIL诊断恶性胸腔积液的AUC值分别为0.815（SE=0.042，95%CI：0.732～0.897）和 0.807（SE=0.043，95%CI：0.723～0.890），均大于CEA诊断恶性胸腔积液 的AUC值0.730（SE=0.051，95%CI：0.629～0.831）。此外，NEAT1和ANRIL联合检测诊断恶性胸腔积液的 AUC值为 0.894（SE=0.031，95%CI：0.833～0.954）。（图1）

图1 NEAT 1、ANRIL和CEA诊断恶性胸腔积液的ROC曲线

2.3 NEAT 1、ANRIL和CEA对恶性胸腔积液的诊断效能

根据ROC曲线分析结果，确定NEAT1、ANRIL诊断恶性胸腔积液的临界值分别为0.0501、0.0006，此时这两个指标诊断恶性胸腔积液的灵敏度及特异度最佳。此外，临床中通常将5.0 μg/L作为CEA的最高临界值。NEAT1和ANRIL联合检测诊断恶性胸腔积液的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度均高于NEAT1、ANRIL和CEA单独诊断的结果。（表1）

表1 NEAT 1、ANRIL和CEA对恶性胸腔积液的诊断效能（%）

2.4 不同临床特征恶性胸腔积液患者中NEAT 1和ANRIL相对表达量的比较

不同肿瘤组织来源、肺癌组织类型、性别、年龄、吸烟史、糖尿病或心血管病发生情况的恶性胸腔积液患者中NEAT1和ANRIL的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

3 讨论

恶性胸腔积液诊断的金标准是组织活检和细胞学检查。胸膜组织活检具有较高的阳性率，但操作复杂，创伤性和风险较大，而细胞学检查虽然操作简便，但灵敏度较低[8-9]。近年来，临床中采用肿瘤标志物鉴别良恶性胸腔积液，CEA被认为是最具有临床价值的肿瘤标志物。尽管有研究报道了CEA鉴别良恶性胸腔积液的临床价值，但其灵敏度和特异度均不理想[10]。随着基因组技术的不断发展，越来越多的研究表明lncRNA不仅能够在肿瘤组织中被检测出，参与恶性肿瘤的发生、发展、转移和侵袭，而且在肿瘤患者的血清、尿液、胸腔积液等易于获得的体液中也均被检测出[11-12]。本研究选择了NEAT1和ANRIL作为目的基因，探讨其在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床价值。

表2 不同临床特征恶性胸腔积液患者中NEAT 1和ANRIL的相对表达量（ n=50）

NEAT1是新发现的一种限制性lncRNA，被誉为众多基因的转录调控因子。近年来的一些研究表明，NEAT1通过多种细胞信号转导途径参与了肿瘤组织的增殖和侵袭。Li等[13]研究发现，NEAT1在肺癌组织中高表达，高表达的NEAT1抑制了高迁移率族蛋白2（high mobility group box protein 2，HMGB2）的表达，从而降低了微小RNA（microRNA，miRNA）-181a-5p的表达水平，促进了肿瘤细胞的增殖和侵袭。Jiang等[4]研究表明，NEAT1在乳腺癌中高表达，并且可以作为竞争性内源RNA，通过与miRNA-448竞争性结合E盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1），从而参与乳腺癌的进展。该研究还证明，NEAT1在肺癌和乳腺癌中的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移和临床分期有关，并且可以作为肿瘤预后的判断指标。本研究结果表明，NEAT1在恶性胸腔积液中的相对表达量明显高于良性胸腔积液（t=6.073，P＜0.01），与上述研究结果相符。本研究结果还显示，不同肿瘤组织来源、肺癌组织类型、性别、年龄、吸烟史、糖尿病或心血管病发生情况的恶性胸腔积液患者中NEAT1的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明恶性胸腔积液患者中NEAT1的表达水平与上述临床特征无关。

ANRIL最先在黑色素瘤中被发现和命名[13]。全基因组关联研究将ANRIL基因作为冠状动脉疾病、颅内动脉瘤、2型糖尿病和恶性肿瘤共同的遗传易感基因位点，使得ANRIL逐渐成为研究的热点[14-15]。越来越多的研究证实，ANRIL在多种肿瘤中发挥着癌基因的作用。Zhang等[16]的研究证实了ANRIL在胃癌组织中高表达，并通过与多梳抑制复合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）结合调控雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）和周期蛋白依赖性激酶 6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）/E2F转录因子 1（E2F transcription factor 1，E2F1）通路并沉默miRNA-99a/miRNA-449a的表达，从而促进肿瘤细胞生长。Nie等[5]研究发现，ANRIL可以通过直接与PRC2的核心亚基zeste增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）结合沉默KLF2的表达以及抑制p21的转录，从而参与肿瘤细胞的增殖。此外，Xu等[17]的研究表明，ANRIL在三阴性乳腺癌中呈高表达，并通过与miRNA-199a的相互作用抑制miRNA-199a的抑癌作用。本研究结果显示，恶性胸腔积液中ANRIL的相对表达量明显高于良性胸腔积液（t=3.463，P＜0.01），且不同肿瘤组织来源、肺癌组织类型、性别、年龄、吸烟史的恶性胸腔积液患者中ANRIL的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明恶性胸腔积液患者中ANRIL的表达水平与上述临床特征无关。有研究表明，ANRIL还与冠状动脉疾病、2型糖尿病等多种人类疾病相关[18-19]。因此，本研究分析了恶性胸腔积液患者中ANRIL表达情况与糖尿病或心血管疾病的关系，结果显示，有糖尿病或心血管疾病和无糖尿病或心血管疾病的恶性胸腔积液患者中ANRIL的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），排除了糖尿病或心血管疾病对恶性胸腔积液患者中ANRIL表达情况的影响。

本研究结果显示，NEAT1和ANRIL在恶性胸腔积液中的相对表达量均明显高于良性胸腔积液，二者诊断恶性胸腔积液的AUC值分别为0.815和0.807，均大于CEA诊断恶性胸腔积液的AUC值0.730。NEAT1和ANRIL联合检测诊断恶性胸腔积液的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度均高于NEAT1、ANRIL和CEA单独诊断的结果。NEAT1诊断恶性胸腔积液的灵敏度和特异度分别为78.0%和84.0%，与CEA的76.0%和82.0%差异不明显。而ANRIL诊断恶性胸腔积液的灵敏度为84.0%，高于CEA的76.0%，但特异度仅为58.0%，假阳性率和误诊率较高。NEAT1和ANRIL联合检测时，其灵敏度和特异度分别为86.0%和92.0%，均高于CEA，假阳性率降低，准确度升高。表明联合检测胸腔积液中的肿瘤标志物对良恶性胸腔积液的鉴别诊断作用更为显著。此外，本研究结果显示，肺癌和非肺癌患者恶性胸腔积液中NEAT1和ANRIL的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明NEAT1和ANRIL在恶性胸腔积液中的表达水平与患者的肿瘤组织来源无关。由于样本主要来源于肺癌，胸腔积液的出现往往提示疾病进入晚期，本研究未能对肿瘤分期进行相关分析，后续将继续扩大样本量，进一步分析肿瘤分期与恶性胸腔积液中NEAT1和ANRIL表达的关系。

综上所述，NEAT1和ANRIL在恶性胸腔积液中的表达水平均高于良性胸腔积液，且其在恶性胸腔积液中的表达水平与肿瘤组织来源、年龄、性别等无关。NEAT1和ANRIL表达水平的检测对良恶性胸腔积液的鉴别诊断具有一定的临床意义，有可能成为鉴别良恶性胸腔积液的生物标志物，而二者联合检测可进一步提高良恶性胸腔积液的诊断效能。