血清7型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与耐药性分析

夏伦斌，陈桂萍，蒋 平，孙桃桃，刘 平

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽六安 237012；2.六安市齐礼农牧科技有限责任公司，安徽六安 237012)

猪传染性胸膜肺炎(Porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一种急性呼吸道传染病，造成感染猪胸膜肺炎与肺部出血性坏死，急性病例死亡率可达80%以上，慢性经过者生长发育受阻，易继发其他病原感染而死亡[1]。猪场一旦感染本病就很难根除，其原因在于存在慢性感染和带菌猪。本病是国际上公认的危害现代养猪业的主要疾病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失[2]。近年来，中国多地报道有该病发生[3-5]，由于APP存在多种血清型，不同地方流行的优势菌株血清型存在差异，不同血清型菌株之间又缺乏交叉免疫性[1]，这给PCP的有效防控增加了难度。猪场对疑似APP感染的猪只，须及时隔离，同时采取病原分离鉴定和筛选敏感药物进行治疗，才能阻断和治疗该病。本研究对安徽省皖西地区一猪场疑似APP感染的实验室诊断和治疗效果进行报道，为该病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 患病猪来源及病料采集 2019年12月，安徽省皖西地区某猪场有12头猪发病，体温升高达40 ℃以上，伴有明显的呼吸道症状，临床症状出现3 d后有2头猪死亡。为了确诊，无菌采集死亡猪鼻腔分泌物和肺脏组织病料，并及时送至皖西学院小动物诊疗实验实训中心进行病原分离培养和鉴定。

1.1.2 培养基与试剂 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，细菌生化鉴定管和标准药敏纸片， 革兰氏染色试剂等均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；APP(1～12型)标准阳性血清购自中国兽药监察所；微生态制剂购自山东宝来利来生物工程股份有限公司；电解多维购自山东富利特药业有限公司；所用治疗药物均购自安徽天安生物科技股份有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司生产；LDZX-75KBS型高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂生产；GHP-9270型恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司生产；BK6000生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司生产；YP5002型电子天平，上海越平科学仪器有限公司生产；其他仪器和耗材均为皖西学院小动物诊疗实验实训中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 临床症状与病理剖检观察 对发病猪进行连续体温检测、精神状态观察并记录；对病死猪进行病理剖检，观察肺脏、气管、支气管、肝脏等脏器的病理变化情况。

1.2.2 病菌的分离培养 无菌采集的病料用划线方法接种于TSA培养基上，37 ℃恒温培养24 h，挑选单个菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察。

1.2.3 血清型鉴定 取单个菌落进行纯培养，然后用灭菌生理盐水制备成适宜浓度的细菌悬液，分别与1～12型APP标准阳性血清进行玻板凝集试验，观察是否出现凝集现象，确定分离株的血清型。

1.2.4 生化鉴定 用接种环无菌挑取单个分离菌株的菌落于细菌生化鉴定管中，37 ℃恒温培养24 h，按照说明书进行鉴定。

1.2.5 药敏试验 采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法进行敏感药物筛选[6-7]，在超净工作台上，将分离的细菌均匀涂布接种在TSA培养基上，分别将6类7种药敏纸片紧贴于培养基表面，纸片间距不小于20 mm，放置于恒温培养箱培养24 h后，观察并测量记录抑菌圈直径的大小，参照美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的标准[8]判定药敏试验结果。

1.2.6 病猪治疗 病猪及时隔离，单独场所饲喂，用筛选的敏感药物进行肌内注射，同时进行对症和提高免疫力治疗。

2 结果与分析

2.1 临床特征与病理剖检观察

发病猪的体质量为20～35 kg，体温 40.3～42.1 ℃，精神沉郁，废食，呼吸困难，张口喘气，打喷嚏，鼻腔带有淡红色泡沫状分泌物，病猪常呈犬坐姿势，咳喘并伴有腹式呼吸，耳部及颈部皮肤有发绀斑块(图1)。病理剖检可见胸膜和肺脏表面有广泛性纤维素渗出，肺与胸壁、纵膈有纤维素性粘连(图2)，肺肿大、充血，呈紫红色(图3)，肺切面似肝，易碎、膈叶有炎性坏死灶，间质充满血色胶样液体(图4)。

2.2 病菌的分离培养

在TSA培养基上可见呈圆形、隆起、表面光滑、灰白色、边缘整齐的半透明小菌落(图5)，革兰氏染色为革兰氏阴性短杆菌，菌体多为球杆菌，较小，有的成双排列(图6)，命名为WXC1901。

2.3 生化鉴定结果

由表1可知，该菌能发酵蔗糖、木糖、果糖，发酵葡萄糖产酸，硝酸盐还原、脲酶、氧化酶和接触酶试验均为阳性，其他如乳糖、阿拉伯糖、蜜二糖、甘露醇、七叶苷、海藻糖、V-P反应和M.R.试验等指标均为阴性，将生化试验结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]对照，确定分离菌WXC1901的生化特性与APP的相一致。

表1 分离菌株WXC1901生化特性鉴定结果

2.4 血清型鉴定结果

分离菌WXC1901纯培养物悬液与血清7型APP标准阳性血清发生明显的凝集现象，与其他型标准阳性血清及生理盐水对照均未见有凝集现象。结果表明分离菌WXC1901为血清7型APP。

2.5 药敏试验结果

由图7和表2可知，分离菌WXC1901对β-内酰胺类药物氨苄西林和多肽类药物万古霉素、多粘菌素B敏感，对环丙沙星、头孢他啶、麦迪霉素和复方新诺明等其他类别药物耐药。

表2 分离菌株WXC1901药敏试验结果

2.6 治疗效果观察

用筛选的敏感药物氨苄西林(兽用氨苄西林钠注射液，每瓶1.0 g)进行肌内注射，按 20 mg/kg体质量给患病猪给药，每日2次，早晚各 1次；柴胡注射液每日2次，每次4 mL，肌内注射；黄芪多糖注射液每日2次，每次5 mL，肌内注射；在饮水中加入微生态制剂(由枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌及其代谢产物等组成，活菌总数≥2.0×108CFU/g，添加量为0.1%)和电解多维(每千克含VA1500 000 IU、VD3300 000 IU、VE1430 mg、VB1500 mg、VB2900 mg、VB121 000 mg、VK3700 mg，VC 600 mg、NaCl 2 000 mg、KCl4500 mg、氨基酸20 000 mg等，辅料为寡糖，含量为0.033%)，供给充足的干净饮水，饲喂采用少饲多餐。用药1 d后，发病猪出现好转，采食量增加，连续用药5 d后，患病猪呼吸道症状基本消失，精神状态和采食量恢复正常，用药后未再出现死亡，具体见表3。

表3 患病猪治疗效果

3 讨 论

本研究结合患病猪临床症状分析，对病原进行分离，生化及血清型鉴定，成功分离并鉴定出1株APP血清7型菌株，将其命名为WXC1901。目前，国内报道的APP流行菌株主要优势血清型为7、1和3型，2、4、5、8、9、10和12型等也有报道[10-11]，本研究分离的血清7型是造成PCP常见的血清型。王丹丹等[12]2019年报道了江苏泰州某规模化养猪场育肥猪感染APP血清8型菌株，李海利等[13]2016年报道鉴定了APP血清3型菌株，郑培等[14]2019年报道了新疆奇台和昌吉市规模化猪场发生育肥猪感染APP血清5型菌株，徐引弟等[15]2019年报道了河南省汝州市某大型规模化养猪场育肥猪感染APP血清1型菌株，李凯明等[4]2020年报道了河南洛阳某猪场感染的APP为血清型5型，由此可见，中国不同地区的规模化猪场常有APP感染，且不同地域的优势血清型存在差异，这给PCP的有效防控增加了难度。原因在于APP不同血清型菌株之间的交叉免疫性弱，目前还没有研制出包括所有血清型菌株抗原的多价疫苗或联苗，如果所预防接种的疫苗株血清型与当地流行株血清型不一致，就不能发挥有效的免疫保护作用。因此，猪场一旦发生PCP，及时隔离患病猪并筛选敏感药物治疗，是阻断APP进一步感染猪群的有效手段。本研究中，分离株WXC1901药敏试验结果显示，其对多种抗菌药物呈多重耐药，这与近几年的一些国内外报道一致[16-20]。同时，药敏试验表明，不同区域的分离株虽然多呈多重耐药，但是耐药的药物类别却有差异，敏感药物也存在差异，从本病例分离的APP菌株WXC1901对β-内酰胺类药物氨苄西林和多肽类药物万古霉素、多粘菌素B敏感，对环丙沙星、头孢他啶、麦迪霉素和复方新诺明等药物耐药，王丹丹等[12]从江苏泰州某规模化养猪场分离的APP对氨苄西林为中介，对头孢他啶敏感，这与分离株WXC1901存在差异；李凯明等[4]报道了河南洛阳的APP分离株对头孢他啶耐药，对氨苄西林和硫酸多粘菌素表现敏感，这与分离株WXC1901是一致的。这种现象可能由于不同区域猪场长期使用的抗菌药物不同所致。

基于APP在中国猪场感染的现状，如何防控PCP的发生，是兽医工作者面临的主要挑战之一。研究者们提出了很多预防措施，如针对当地优势菌株做好疫苗接种、改善饲养环境、给予均衡营养、施行全进全出制、做好生物安全防护以及加强猪支原体病、伪狂犬病、繁殖与呼吸障碍综合征等疾病的预防[21]。结合本病例，笔者认为猪群一旦疑似感染APP ，应从以下三方面进行防控：一是及时对有临床症状或密切接触猪进行隔离，并全场进行消毒；二是根据临床症状进行初步诊断，及时分离病原并筛选敏感药物；三是用筛选的敏感药物进行治疗，同时采用对症治疗、提高猪体免疫力等治疗措施。采用以上措施，本研究中的发病猪场对该病取得了较好的治疗效果，减少猪场的损失，为猪场诊断和治疗APP感染提供参考。