博斯腾湖沉积物氨氧化细菌的筛选与鉴定

马晓林，李远婷，田永芝，张建平，安登第

(1.新疆特殊环境物种多样性应用与调控重点实验室,新疆师范大学，乌鲁木齐 830054；2.新疆巴音郭楞蒙古自治州环境监测站，新疆库尔勒 841000 )

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集 以博斯腾湖大湖区布设的17个国家基准环境监测站位[23]中的2、6、8、11、12和14号共6个位点为研究对象(图1)，于2015年8月以活塞式柱状底泥采样器(KHT0204)收集40 cm厚度沉积物样品，以20 cm为梯度将其分为表层(0～20 cm)和深层(20～40 cm)共计12个样品，在无菌环境下充分混匀分装置-80 ℃保存。同时收集上覆水样品置于无菌瓶中-4 ℃ 保存。

1.1.2 培养基 铵盐富集培养基参照李焕等[24]配方的基础上做适当调整。磷酸二氢钠0.75 g，磷酸氢二钾0.25 g，硫酸铵2 g，硫酸镁0.01g，硫酸锰0.03 g，碳酸钠0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，1×105Pa灭菌30 min，固体培养基加入15%的琼脂粉。

1.2 方 法

1.2.1 水体环境因子的检测 采用美国YSI EXO2多参数水质分析仪现场监测水体pH、溶解氧、温度及电离度。参照国标(GB11894-89)[25]碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮含量；参照国标(HJ 537-2009 )[26]蒸馏-中和滴定法测定氨氮的含量。

1.2.2 沉积物微生物的富集培养 称取10 g沉积物样品到90 mL无菌水中，加入玻璃珠于摇床震荡3 h后静置30 min。吸上清菌液1 mL移至50 mL铵盐富集培养基中，25 ℃ 120 r/min避光培养30 d，从第9天起每3 d测定各培养液OD600值，掌握菌株的生长情况及菌液中亚硝酸盐的含量。N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法检验亚硝酸盐的生成[7]。

1.2.3 单菌的分离纯化 11个(20～40 cm)沉积物样品经富集培养21 d后(此时菌液中亚硝酸盐含量较高)取混合菌液做梯度稀释并以涂布法接种至铵盐培养基上于25 ℃培养。每隔3～5 d挑取单菌落画线培养直至革兰氏染色鉴定为单个菌株。将单菌株接种于液体培养基，期间每隔2 d取适量菌液检测生长曲线和亚硝酸盐含量。

1.2.4 16S rRNA基因分析 提取纯化的单菌株总DNA，采用16S rRNA基因通用引物27F 和1492R扩增目的片段，PCR产物送上海生工生物工程公司测序。

1.3 数据分析

16S rRNA基因测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，鉴定菌种分类并提交菌株序列获得登陆号。采用GraphPad Prism 5.01软件进行数据分析并作图。

2 结果与分析

2.1 上覆水中氮含量检测

了解水体环境因素有利于分析氨氧化菌的生物脱氮能力从而更好的分离有效的氨氧化细菌。对博斯腾湖不同区域水体总氮含量检测显示，水质符合国家III及IV类水标准，适用于养殖产业和旅游业，不能用作城乡生活用水(表1)。除6号采样点上覆水有轻度氮污染外其余位点水质良好，该结果基本与2015年环境状况公报一致[6]。11号采样点氨氮含量占总氮含量的65.8%，表明外源氮的输入偏高。通过采样实地考察结合张明[27]对博斯腾湖面源污染现状分析表明该水域外源性氮污染主要受西部沿岸农业灌溉和北部鱼虾养殖双重影响。湖泊整体溶解氧质量浓度均值为7.8 mg/L，表明水体含氧量充足。上述结果与巴雅尔等[28]报道的湖泊环境状况趋势一致，亦是对博斯腾湖大湖区生态健康状况评价的一个 补充。

表1 各采样位点水体环境因素检测结果Table 1 Characterization of sampling water of six sites of Bosten Lake

注：水质标准以总氮含量判断。

Note:Water quality standard judged by total nitrogen content.

2.2 沉积物混合菌株富集培养及亚硝酸盐含量分析

根据采样位点上覆水及底泥温度，将沉积物富集培养温度确定为25 ℃。氨氧化细菌多为好氧细菌，生长周期长，生长缓慢[20]，根据前期试验将培养时间确定为30 d。通过检测培养液中亚硝酸盐含量及变化规律有助于筛选有效的氨氧化细菌。如图2所示，不同水域同一深度沉积物样品混合菌液对铵态氮的响应差别较大，2、6、11和12号位点沉积物混合菌液中亚硝酸盐含量随培养时间的增加波动较大。由于亚硝酸盐是硝化作用的中间产物，其含量主要受氨氧化细菌和亚硝酸氧化菌的协同作用影响[12]，上述结果表明沉积物富集培养液中各种氨氧化菌的协同脱氨作用明显；同一水域，表层沉积物(0～20 cm)混合菌液对铵态氮的响应迅速且波动幅度较大。尤其是2、6和12号位点表层沉积物混合菌液亚硝酸盐含量变化明显且迅速(在培养第9天就检测到溶液中高含量的亚硝酸盐)，而深层沉积物对铵盐的响应较迟缓，表明表层沉积物微生物较易受环境因素影响[29-30]。另外，值得注意的是深层沉积物中亦存在高效转氨作用的氨氧化细菌(6号及11号位点)；沉积物混合菌液对铵态氮的响应表现出两种不同的方式。一种方式表现为2(0～20 cm)、6 (0～20 cm)和6(20～40 cm)沉积物微生物均能在第9天～第12天内很快产生亚硝酸盐并使其达到一个峰值，进而又在第12天～第15天使其含量下降至最低水平。在27 d 的培养周期内亚硝酸盐含量出现两次瞬时峰值。另一种方式表现为12(0～20 cm)和11(20～40 cm)号沉积物混合菌株约需要用3 d(第18天～第21天)时间积累溶液中亚硝酸盐且在接下来3 d内将其稳定维持在较高水平。其中11(20～40 cm)混合菌液溶液亚硝酸盐质量浓度最高可达26.16 mg/L并稳定维持6 d，随后逐渐下降。高氨氮浓度有利于氨氧化反应的进行[31]，结合水体氨氮含量分析表明上覆水中高浓度的氨氮含量是导致11号位点沉积物微生物有效响应铵盐的原因之一。

为了初步了解这两种不同脱氨方式可能的原因，分析亚硝酸盐含量表现为典型瞬时波动和持续累积的4个沉积物混合菌液的生长情况。从图3中可以看出，6(0～20 cm)和6(20～40 cm)样品混合菌株的生长情况与亚硝酸盐的积累量没有明显关系。12(0～20 cm)和11(20～40 cm)样品中亚硝酸盐的含量随着菌液浓度的增加而升高，其中11(20～40 cm)样品培养液中亚硝酸积累量最高，说明该混合菌液中存在有效氨氧化作用的氨氧化细菌，可进一步将其分离纯化。另外，研究表明深层土壤/沉积物中多数为厌氧氨氧化细菌，其对环境中无机氮的利用效率较好氧氨氧化菌更高[32-34]。11号位点深层沉积物中的氨氧化菌可能与厌氧氨氧化有关。

2.3 单菌的分离纯化及氨氧化作用的检测

从亚硝酸含量最高的11(20～40 cm)混合菌液中分离纯化出30株单菌分析其氨氧化能力。最终筛选出两株有效脱氨作用的氨氧化细菌(BSL4.6和BSL4.10)。 如图4所示，纯化菌株在培养的第2天～第4天进入指数生长期，随后进入平台期。溶液中亚硝酸盐含量随菌液浓度的增加而升高，即第2天～第6天成指数增长，随后逐渐缓慢积累至平台期直至培养到第18天时，两个株菌均呈现二次生长趋势，此时溶液中亚硝酸盐浓度有所下降，表明菌株可能利用溶液中的亚硝酸盐为底物生长。

2.4 单菌16S rRNA基因序列分析及形态鉴定

以单菌总DNA为模板扩增16S rRNA基因序列，产物测序后经BLAST分析表明，菌株BSL4.6与赤红球菌属(Rhodococcus)的多个菌株相似率为100%；BSL4.10与弯曲芽孢杆菌属(Bacillus)多个菌株相似率为100%。革兰氏染色结果进一步显示BSL4.6为球状革兰氏阳性菌，BSL4.10为杆状革兰氏阳性菌。综上所述，初步鉴定菌株BSL4.6属于赤红球菌(Rhodococcusruber)，菌株BSL4.10属于弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)并获得登录号如表2所示。本研究中菌株BSL4.6和BSL4.10能利用铵盐为唯一氮源生长且能将铵盐转化为亚硝酸盐，因此鉴定其为氨氧化细菌。

表2 菌株的分类Table 2 Identification of strains

3 讨 论

气候变化和人类活动加剧了博斯腾湖富营养化程度，尤其是近年来农业灌溉和渔业养殖导致西部沿岸水体矿化度明显偏高[35]。研究表明，在富营养化水体中氨氧化细菌通常在氨氧化过程中发挥主导作用[36]。因此，本文着重以博斯腾湖西部沿岸4个、北部和南部沿岸各1个位点共6个水域的水体和沉积物为对象，开展水环境因子及氨氧化细菌活性的相关研究。

湖泊沉积物氨氧化细菌的组成及氨氧化能力主要受水体盐度、溶解氧、温度、pH及无机盐等因素影响[37-39]。其中，氨氮浓度的增加会导致氨氧化细菌种群丰度的增大，而菌群丰度大小可以大致反映硝化势的高低[40]。以日本淡水湖泊北浦湖为例，由于沿湖周边农业灌溉和养殖活动，导致水体氨氮浓度极大增高，促进了沉积物中氨氧化菌群丰富度及活性[41]。本研究结果显示，博斯腾湖大湖区水体基本为中度营养，外源性氨氮输入量峰值出现在湖泊西岸11号位点，原因是由灌溉排水和北部鱼虾养殖输入大量矿物盐[35]。同时，对6个采样点表层(0～20 cm)和深层(20～40 cm)共12个沉积物样品中氨氧化菌群在高铵盐浓度下的活性分析发现，11号水域沉积物菌群氧化铵盐为亚硝酸盐的能力最强，表明该菌群中存在有效的氨氧化细菌。上述结果与前人报道一致，即在氨氮浓度较高的水域，氨氧化细菌的丰度及氨氧化作用更明显[42]。

深层沉积物取样较困难，故对湖泊沉积物氨氧化菌的研究大都集中在表层(0～30 cm范围)。受水体营养因素及环境条件影响，表层沉积物氨氧化菌无论从菌群丰度和氨氧化能力上均表现出较为迅速的环境响应[43]，尤其在高浓度铵盐压力下表层氨氧化细菌的丰度和氨氧化效果都有所增加[42]。与上述结果类似，本研究结果表明大部分采样位点表层沉积物对铵盐的响应更为迅速，波动幅度大。2、6、11和12号位点在检测初期均显示出较高的亚硝酸盐积累量，但其响应强度及波动幅度因水域不同而有所差异。对于湖泊深层沉积物氨氧化菌的报道多集中于菌群结构组成及丰度的环境因子响应方面，而对氨氧化活性的研究鲜有报道。本研究表明淡水湖泊深层沉积物 (20～40 cm)亦存在较高活性的氨氧化细菌群，其利用铵盐生成亚硝酸盐的量远远高于表层沉积物。可能的原因是：表层沉积物氨氧化菌群结构更复杂，具有协同响应作用；深层沉积物结构较单一且富含大量厌氧氨氧化菌，其在高氨氮浓度压力下其氧化作用尤为明显[34]。随后将进一步检测各位点不同深度沉积物氨氧化菌群组成及丰度以明确其产生高氨氧化活性的原因。

由于培养条件严苛、分离纯化难度大，生长周期长等原因，从自然界中获得可培养的氨氧化细菌种类有限，而从深层沉积物中获得可培养的具有活性的氨氧化细菌更少。对太湖富营养湖区氨氧化菌群结构多样性分析发现，沉积物氨氧化细菌群落主要包括亚硝化单胞菌(Nitrosomonas) 和亚硝化螺菌(Nitrosospira) 两大属[15]。与之不同，本研究从11号深层沉积物中分离的两株氨氧化细菌分别为赤红球菌属(Rhodococcus)和弯曲芽孢杆菌属(Bacillus)。与氨氧化细菌的特性一致[44]，这两株菌均能以铵盐为唯一氮源将其转化为亚硝酸盐，且这一活性随着菌株浓度的增加而升高，尤其在培养的第2天至第4天，随后溶液中的亚硝酸含量一直较稳定的维持较高水平，表明这两株菌均为氨氧化细菌。后续实验将分别详细鉴定菌株的理化性质、氨氧化活性及其环境响应特性，为干旱内陆湖泊的原位修复做好菌种资源储备。

4 结 论

中度营养化的干旱内陆淡水湖泊博斯腾湖沉积物中富含氨氧化细菌。从水平分布来看，西部水域11号位点沉积物氨氧化细菌活性高于其他水域，水体高氨氮含量是导致该结果的原因之一。从垂直分布来看，表层沉积物氨氧化菌群对氨氮的响应迅速，亚硝酸盐积累量波动明显，混合菌群表现出协同脱氨作用；深层沉积物亦存在高效的氨氧化细菌群，其对铵盐响应虽相对迟缓，但反应强烈且稳定(11、12号位点)。从11(20～40 cm)混合菌株中分离纯化得到两株(BSL4.6和BSL4.10)可培养的具有明显活性的氨氧化细菌，分别鉴定其为赤红球菌(Rhodococcusruber)和弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)。据此，本研究丰富了对博斯腾湖沉积物氨氧化细菌功能的认识，为干旱内陆淡水湖泊氮污染修复提供了菌种 储备。