槲皮素对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化抑制作用和肝保护作用①

陈文龙 戴富臻 邵正勇 蒋 利 徐明清

(成都市龙泉驿区第一人民医院普外科，成都 610100)

肝纤维化是一种慢性肝损伤疾病，其特点是细胞外基质的过度积累和正常肝脏结构的扭曲[1]。由于持续的慢性肝损伤，肝纤维化可发展为肝硬化、肝细胞癌，严重时甚至导致死亡[2]。因此肝纤维化在不同的慢性肝病的发生发展中都起着至关重要的作用。因此，阐明肝纤维化的分子机制和寻找治疗肝纤维化有效的药物十分重要。据报道，槲皮素具有广泛的药理特性，具有抑制肝纤维化的作用[3]。然而，槲皮素的抗纤维化机制迄今尚未完全阐释清楚。本文旨在探究槲皮素对大鼠肝纤维化和炎症的作用和机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 6～8周龄健康Wistar大鼠，雄性，体重150～200 g，购自江苏省实验动物中心，大鼠饲养标准环境中。

1.1.2主要试剂 槲皮素购自美国Selleck公司；CCl4购自江苏强盛化工有限责任公司；TRIzol试剂(15596026)购自美国Invitrogen公司；PrimeScript RT试剂盒(#6210A)和SYBR green(#RR420Q)购自日本TaKaRa公司；IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒购自美国R&D公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝公司；丙氨酸转氨酶(ALT)生化分析试剂盒(C009-1)、天冬氨酸转氨酶(AST)生化分析试剂盒(C010-2)和羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)试剂盒(A030-2)购自南京建成生物技术研究所；anti-α-SMA(ab5694)、anti-collagen-I(ab34710)和anti-β-catenin(ab32572)抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型建立 大鼠肝纤维化模型根据文献[4]建立。Wistar大鼠分为5组(n=10)：对照组：灌胃橄榄油；模型组：大鼠给予CCl4(CCl4：橄榄油=1∶1，2 ml/kg)灌胃，每周3次，共8周，诱导肝纤维化；低中高剂量治疗组(EXP-L、EXP-M、EXP-H)：3组大鼠分别灌胃榭皮素 15、30和50 mg/kg，每天1次，连续4周；再灌胃CCl4(50%CCl4/橄榄油，2 ml/kg)，每周3次，连续4周。8周后颈椎脱臼处死，立即采集各组大鼠肝脏。

1.2.2HE染色 处死大鼠后取肝组织，将肝组织固定在4%多聚甲醛，切成5 μm厚的切片。将各组大鼠肝肺组织石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min ；按照标准步骤进行HE染色，在生物显微镜下观察组织病变情况并拍照。同时采集血样，测量血清中ALT和AST含量。

1.2.3HYP检测 采用文献报道的肝HYP法测定肝胶原蛋白含量，并对其进行少量修饰[5]。即将速冻肝组织在5 ml 6 mol/L 浓HCl中于110℃水解16 h。过滤水解产物，真空蒸发掉盐酸，并将沉淀物溶于 1.2 ml 50%异丙醇中，并与0.2 ml的0.84%氯胺-T在42 mmol/L乙酸钠，2.6 mmol/L柠檬酸中酸和39.5%(vol/vol)异丙醇(pH 6.0)，室温下孵育10 min。随后添加溶解于0.27 ml 60%高氯酸和0.73 ml的异丙醇中的0.248 g对二甲基氨基苯甲醛，50℃下孵育90 min。然后，在558 nm处以光度法对相对羟基脯氨酸进行定量(相对羟脯氨酸(μg/g肝脏)是根据个体肝脏重量计算的)。

1.2.4ELISA检测炎症因子水平 注射6 h后将各组大鼠血液收集到不同的离心管，5 000 r/min离心10 min，血清获得和存储-20℃到使用。血清炎症细胞因子(IL-6，TNF-α，IL-1β)水平根据说明书进行ELISA检测。

1.2.5RT-PCR 采用TRIzol试剂按标准程序从肝组织中提取总RNA。用PrimeScript RT试剂盒合成第一链cDNA，以总RNA(2 μg)为模板。采用SYBR green一步法RT-PCR系统定量表达目标基因mRNA。RT-PCR分析的条件如下：①预热期：95℃ 30 s；②循环阶段：95℃ 5 s，60℃ 34 s，40次循环；③熔融曲线阶段：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。将GAPDH扩增为内参基因。PCR中使用的引物序列如表1所示。用循环阈值(Ct)测量表达水平，然后用2-ΔΔCt方法将其归一化为GAPDH表达。

1.2.6Western blot 提取肝脏总蛋白；取20 μg蛋白与适量Loading buffer混合，100℃煮沸10 min；上样到SDS-PAGE凝胶电泳中分离蛋白，并转移至PVDF膜；5%的脱脂奶粉室温封闭1～2 h；分别加入一抗，anti-α-SMA、anti-collagen-Ⅰ和anti-β-cate-nin，4℃过夜孵育，次日，TBST清洗后再加标记HRP的二抗，室温孵育1 h，清洗。最后加入发光液，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并用Image J软件统计灰度值计算相对表达量。GAPDH作为内参，至少进行3个独立的重复实验。

2 结果

2.1榭皮素改善CCl4诱导的肝损伤 如图1A所示，与对照组相比，模型组大鼠肝组织表现出明显的肝损伤，出现大量空泡，细胞形态异常；与模型组相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H组上述细胞损伤特征明显减少，说明榭皮素以剂量依赖的方式降低CCl4诱导肝损伤。如图1B所示，与对照组相比，模型组AST和ALT活力均显著增加(P<0.01)；与模型组相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H组AST和ALT活力随槲皮素剂量增加依次下降(P<0.01)，该结果进一步说明榭皮素改善CCl4诱导的肝功能损伤。

表1 引物序列

2.2榭皮素减少CCl4诱导的HYP增加 如图2A所示，与对照组相比，模型组肝/体重之比明显增加(P<0.01)；与模型组相比，EXP-H组肝/体重之比下降，且差异有统计学意义(P<0.01)。如图2B所示，与对照组相比，模型组HYP含量明显增加(P<0.01)；与模型组相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H组HYP含量随槲皮素剂量增加依次下降(P<0.01)，说明榭皮素减少CCl4诱导的HYP。

图1 榭皮素改善CCl4诱导的肝损伤

图2 榭皮素减少CCl4诱导的肝损伤Fig.2 Quercetin ameliorates liver injury induced by CCl4Note:A.Histogram of liver/body weight ratio;B.Liver HYP assay was used to detect HYP content.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

2.3榭皮素减少CCl4诱导的炎症反应 如图3所示，与对照组相比，模型组炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平显著提高(P<0.01)；与模型组相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H组IL-6、TNF-α和IL-1β水平随槲皮素剂量增加依次下降(P<0.01)，说明榭皮素减少CCl4诱导的炎症反应。

图3 榭皮素减少CCl4诱导的炎症反应Fig.3 Quercetin reduced inflammatory response induced by CCl4Note:ELISA detected concentrations of IL-6(A),TNF-α(B),and IL-1β(C).Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

图4 槲皮素抑制α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表达Fig.4 Quercetin inhibited expression of α-SMA and collagen-ⅠNote:A.Western blot detects protein expression;B.Relative protein expression.1.Control group;2.Model group;3.EXP-L group;4.EXP-M group;5.EXP-H group.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

图5 槲皮素抑制COL1A1和COL3A1 mRNA表达Fig.5 Quercetin inhibited mRNA level of COL1A1 and COL3A1Note:Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

图6 槲皮素抑制Wnt2和β-catenin表达Fig.6 Quercetin inhibited expression level of β-catenin and Wnt2Note:1.Control group;2.Model group;3.EXP-L group;4.EXP-M group;5.EXP-H group.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

2.4槲皮素抑制α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表达 如图4所示，与对照组相比，模型组α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H组α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表达水平随槲皮素剂量增加依次下降(P<0.01)。

2.5槲皮素抑制COL1A1和COL3A1 mRNA表达 如图5所示，与对照组相比，模型组COL1A1和COL3A1 mRNA水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H组COL1A1和COL3A1 mRNA水平随槲皮素剂量增加依次下降(P<0.01)，该结果进一步说明榭皮素减少CCl4诱导的胶原增加。

2.6槲皮素抑制β-catenin/Wnt信号通路 如图6所示，与对照组相比，模型组β-catenin和Wnt2蛋白表达水平显著提高(P<0.01)；与模型组相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H组β-catenin和Wnt2蛋白表达水平随槲皮素剂量增加依次下降(P<0.01)，结果表明槲皮素可能抑制β-catenin/Wnt信号通路。

3 讨论

肝纤维化是慢性肝损伤的创伤愈合反应，是肝衰竭、肝硬化和癌症的潜在诱因。这种渐进的病理过程是由于细胞外基质蛋白的积累造成的[6]。CCl4是一种肝毒素，常被用来诱导小鼠或大鼠发生毒素介导的实验性肝纤维化[7]。在肝脏中，CCl4引起毒性三氯甲基(CCl3)自由基，引起炎症反应，激活HSCs，产生细胞外基质，最终导致严重肝损伤[3]。本研究采用2 ml/kg CCl4剂量，每周3次，连续8周诱导大鼠肝纤维化。结果显示CCl4处理导致肝细胞广泛坏死且出现脂肪空泡，说明本研究成功建立了肝纤维化模型。

近年来，中药抗纤维化治疗因其毒性低、副作用少等优点而越来越受到重视。槲皮素是一种多酚类黄酮，含有许多酚类羟基，具有较强的抗炎和抗氧化性能[8]。实验数据表明槲皮素具有肝保护和抑制肝纤维化的作用[3,9]。本研究表明，榭皮素能有效改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。CCl4诱导Ⅰ型胶原蛋白的表达水平以及Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达水平增加，而榭皮素以剂量依赖的方式抑制CCl4诱导的胶原聚集，提示榭皮素具有抑制肝纤维化的作用。同时，榭皮素能明显降低羟脯氨酸含量，说明榭皮素降低CCl4大鼠总胶原含量，进一步证明榭皮素对CCl4诱导的肝纤维化有一定的改善作用。

肝细胞损伤促进炎症细胞因子的分泌，直接促进肝细胞的活化，因此肝细胞的损伤也是肝纤维化发生的最初因素[10]。许多研究表明，榭皮素能保护CCl4所致的急性肝损伤[11-13]。与上述研究一致，本文表明，榭皮素改善肝功能，如降低血清ALT/AST水平、炎症因子水平、肝/体重之比和组织病理学病变，暗示榭皮素对肝细胞有较强的保护作用。

激活典型的β-catenin/Wnt通路是肺、肾和肝等器官纤维化疾病的一个重要特征[14]。在肝纤维性疾病中抑制该途径已被证明能抑制肝纤维化[15-17]。本文研究表明，CCl4激活了β-catenin/Wnt通路，而榭皮素抑制β-catenin的表达，可能抑制该通路。本文结论提示榭皮素可能通过抑制β-catenin/Wnt通路发挥肝纤维化抑制作用和肝保护作用。

综上所述，本文研究结果表明榭皮素具有抗CCl4诱导的肝纤维化作用，并对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠具有保护作用。