SPINK7对IL-22介导的角质细胞异常增殖及炎症应答的影响①

张鼎伟 张燕飞 汪 炜 霍 佳 杨珮雯 张钰汇 王 媛

(西安交通大学第二附属医院皮肤科，西安 710004)

银屑病是一种T细胞介导的常见的慢性炎症性皮肤病，主要表现为表皮角质形成细胞过度增殖，分化异常，免疫细胞浸润，促炎细胞因子释放等[1]。尽管其发病潜在机制非常复杂，尚不明确，但免疫功能障碍在该病的发病过程中起着至关重要的作用，特别是T细胞和角质形成细胞介导的免疫反应参与了银屑病的发生和维持。免疫细胞产生大量的细胞因子，如IL-17、IFN-γ、TNF-α和IL-22，这些细胞因子又作用于角质形成细胞以加重银屑病炎症，最终导致角质形成细胞的增殖、分化、凋亡异常，形成了临床可见的银屑病特征性皮损[2]。

免疫系统在银屑病的发病过程中起着至关重要的作用，免疫细胞产生的大量炎症细胞因子促进角质形成细胞的增殖。在银屑病的皮肤区域，促炎细胞因子和趋化因子的表达升高，吸引免疫细胞，导致局部和侵袭细胞的增殖。IL-17、IL-22、TNF-α等多种炎症因子被认为是银屑病的重要病理因素。IL-22主要是由多种免疫细胞比如Th17和Th22产生，在T细胞介导的免疫应答中发挥重要作用[3]。IL-22通过诱导角质形成细胞快速增殖，并特异性表达IL-22受体，从而导致银屑病的发病[4]。此外，IL-22在银屑病患者的血清中高表达，且与疾病严重程度呈正相关[5]。IL-22在银屑病的发病机制中发挥非常重要的作用，常被用于体外诱导角质形成细胞炎症或异常增生作为银屑病的研究模型[6]。

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor kazal type，SPINK)家族是一类具有Kazal结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂，与多种人类疾病发生、发展密切相关[7]。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子7(SPINK7)，又名食管癌相关基因2(ECRG2)是SPINK家族的重要成员，与皮肤等组织的炎症性疾病相关。有研究报道SPINK7在银屑病和湿疹等炎症性皮肤病中表达上调[8]。本研究通过利用IL-22刺激人角质形成细胞HaCaT细胞建立的炎症模型，探讨SPINK7对IL-22诱导人角质形成细胞HaCaT增殖能力及炎症应答的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 HaCaT角质形成细胞购自中国科学院昆明细胞库；胎牛血清、DMEM培养基和胰酶购自美国Gibco公司；MTT试剂盒和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；Trizol试剂盒和细胞转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；IL-23、TNF-α和IL-17A检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；anti-SPINK7抗体购自美国Invitrogen公司；anti-cyclin D1、anti-survivin、anti-β-catenin和anti-c-Myc抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；anti-β-actin抗体购自美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将HaCaT置于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM高糖培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后更换新鲜的完全培养液，继续培养、传代。选择对数生长期的细胞进行试验。用100 ng/ml IL-22刺激HaCaT细胞，模拟银屑病炎症模型。

1.2.2SPINK7 siRNA序列为5′-AAAGTAATGGAAGAGTTCAGTTT-3′，由上海GenePharma公司合成。使用BgⅢ和HindⅢ限制酶将siRNA寡核苷酸序列克隆至pSUPER.Retro.puro逆转录病毒载体，构建pSUPER.Retro.puro-SPINK7-siRNA质粒，并经测序分析验证。

1.2.3RT-PCR检测mRNA表达 采用TRIzol法按照说明书步骤提取细胞总RNA，紫外分光光度计进行RNA定量。按逆转录试剂盒说明书将RNA进行逆转录合成cDNA。采用SYBR Green Master荧光定量PCR试剂在7900HT荧光定量PCR仪上进行反应以检测目的基因的mRNA相对表达量。

1.2.4Western blot检测蛋白表达 转染后48 h，收集各组细胞，提取细胞总蛋白，通过BCA法检测总蛋白浓度。运用SDS-PAGE分离蛋白质，电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次；用ECL化学发光剂孵育，显色终止后用凝胶成像仪进行拍照采集图片，并用Image J图像分析软件进行条带的灰度值分析，以目的蛋白灰度值/内参β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.2.5MTT法检测细胞活力 将各组细胞接种至96孔板中，每孔细胞数为5×103个，放置于细胞培养箱中孵育。转染24 h后弃去培养基，每孔加 20 μl 浓度为5 mg/ml的MTT培养液，37℃培养箱中继续孵育4 h，弃去上清，每孔加150 μl DMSO室温振荡10 min，使结晶物充分溶解。用全自动酶标仪在 490 nm 波长处测定各孔吸光度值。

1.2.6ELISA法检测细胞上清液中的IL-23、TNF-α和IL-17A 收集各组细胞上清液，采用ELISA法分别检测上清液中IL-23、TNF-α和IL-17A的表达水平，参照ELISA试剂盒说明书分别测定450 nm波长处各孔吸光度值。

2 结果

2.1IL-22诱导HaCaT细胞中SPINK7高表达 检测IL-22刺激对HaCaT细胞中SPINK7表达量的影响，结果如图1所示，HaCaT细胞经IL-22处理后，SPINK7的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，说明IL-22能够诱导SPINK7表达上调。为进一步研究SPINK7在银屑病发病机制中的作用，采用小干扰RNA技术抑制HaCaT细胞中SPINK7表达量，并利用RT-PCR和Western blot检测SPINK7的mRNA和蛋白表达水平以评价转染是否成功。结果如图1所示，si-SPINK7转染有效降低了HaCaT细胞中SPINK7的表达水平。

2.2SPINK7沉默抑制IL-22诱导的HaCaT细胞增殖 IL-22可诱导培养的角质形成细胞的增殖。为研究SPINK7是否能够参与调节角质形成细胞增殖，MTT法检测结果如图2A显示，与Control组相比，IL-22作用于HaCaT细胞后可明显诱导细胞增殖；而SPINK7沉默对IL-22诱导的细胞增殖有明显的抑制作用；该结果表明SPINK7沉默显著抑制IL-22-诱导的HaCaT细胞生长。进而利用Western blot检测SPINK7沉默对IL-22刺激的HaCaT细胞中cyclin D1及survivin表达的影响。结果如图2B、C显示，IL-22刺激显著上调cyclin D1及survivin表达量；而SPINK7沉默后，cyclin D1及survivin表达水平明显降低。由此推测SPINK7沉默可能通过下调cyclin D1及survivin表达从而抑制IL-22诱导的HaCaT细胞生长。

2.3沉默SPINK7抑制IL-22诱导的HaCaT细胞炎症损伤 RT-PCR检测SPINK7对IL-22刺激的炎症反应的影响，结果如图3A、C所示，与Control组相比，IL-22诱导HaCaT细胞中IL-23、TNF-α和IL-17A mRNA的表达水平均显著升高；而沉默SPINK7后能够降低炎症因子IL-23、TNF-α和IL-17A的mRNA的水平。进一步用ELISA检测上清中细胞因子分泌水平，结果如图3D～F显示，IL-22处理后促炎症细胞因子IL-23、TNF-α和IL-17A的含量均有所增加；抑制SPINK7后显著降低细胞上清中IL-23，TNF-α和IL-17A的表达量。上述结果表明SPINK7沉默通过下调炎症因子表达，阻断IL-22诱导的炎症反应，从而发挥对角质形成细胞的保护作用。

图1 IL-22诱导的HaCaT细胞中SPINK7高表达Fig.1 SPINK7 was enhanced in IL-22-stimulated HaCaT cellsNote:A.The mRNA expression of SPINK7 was detected using RT-PCR assay；B.Western blot analysis was conducted to measure the protein level of SPINK7.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

图2 SPINK7对IL-22诱导HaCaT细胞增殖的影响Fig.2 Effects of SPINK7 on IL-22-induced HaCaT cell proliferationNote:A.MTT assay was applied to evaluate cell proliferation；B and C.The protein expression of cyclin D1 and survivin was determined using Western blot analysis.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

图3 SPINK7对IL-22诱导的HaCaT细胞炎症反应的影响Fig.3 Influence of SPINK7 on IL-22-stimulated inflam-mation response in HaCaT cellsNote:A～C.The mRNA expression of inflammation factors IL-23,TNF-α and IL-17A was evaluated using RT-PCR assay；D～F.ELISA assay was performed to estimate the production of inflammation mediators.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

图4 SPINK7对Wnt/β-catenin信号通路的影响Fig.4 Effects of SPINK7 on Wnt/β-catenin signalingNote:Western blot was applied to detect the expression of β-catenin and c-Myc.*.P<0.05 vs Control;#.P<0.05 vs IL-22+si-NC.n=3.

2.4沉默SPINK7抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活 Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平，结果如图4显示，IL-22刺激显著增加Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin表达量，其下游靶基因c-Myc表达水平也明显升高，从而激活Wnt/β-catenin信号通路；SPINK7沉默后，β-catenin和c-Myc的蛋白表达水平下降，提示沉默SPINK7能够抑制IL-22激活的Wnt/β-catenin信号通路。

3 讨论

银屑病是一种以角质形成细胞异常增殖分化和免疫细胞浸润为特征的慢性炎症性皮肤病。HaCaT细胞为人永生化的角质形成细胞，具有无限增殖、易培养、稳定性好等特点，且其生物学特性与人原代角质形成细胞几乎一致。因此，本研究采用IL-22刺激HaCaT细胞体外模拟角质形成细胞过度增殖的病理状态即类银屑病病理模型。有研究报道SPINK7在银屑病中高表达，而本实验表明IL-22处理导致SPINK7的mRNA及其蛋白表达显著升高，说明SPINK7在银屑病发展中具有重要作用。

角化细胞的过度增殖和皮肤组织的持续炎症是银屑病的主要病理过程。角质形成细胞异常、过度、快速增殖是皮肤病变的重要原因，已知各种因素可导致角质形成细胞过度增殖。Cyclin D1是原癌基因，在细胞G1/S转换中起促进作用；survivin是凋亡蛋白抑制剂家族中的成员，是迄今发现的作用最强的凋亡抑制因子，具有促进细胞增殖的作用。本研究发现SPINK7沉默对IL-22诱导的HaCaT细胞异常增殖具有明显抑制作用。同时SPINK7沉默明显抑制IL-22诱导的HaCaT细胞中cyclin D1和survivin表达，提示SPINK7沉默可能通过抑制cyclin D1和survivin的表达发挥抑制IL-22诱导的HaCaT细胞增殖。

银屑病是一种慢性皮肤炎症性疾病，控制病理过程中的炎症反应将有助于银屑病疾病的预防和治疗。大量文献表明，免疫系统在银屑病发病机制中发挥着关键作用，免疫细胞产生的大量炎症细胞因子(IL-17、IL-22等)能够促进角质形成细胞的增殖[9]。有证据表明，趋化因子和炎症细胞因子的异常分泌导致了疾病的进展[10]。在参与炎症反应的众多介质中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17都是与炎症密切相关的因子，参与HaCaT细胞的炎症反应。而IL-23、Th17轴在银屑病发生发展中起重要作用[11]。本实验结果显示，IL-22刺激明显导致HaCaT细胞内促炎症因子IL-23、TNF-α和IL-17A的表达水平显著上升，而SPINK7沉默后抑制这些炎症因子的分泌，从而减轻细胞的炎症反应。上述结果提示沉默SPINK7可能通过抑制增殖及炎症因子的释放，从而发挥抗银屑病的作用，SPINK7有望成为银屑病治疗的新靶点。

进一步探讨沉默SPINK7对IL-22诱导HaCaT增殖和炎症应答调控的分子机制。Wnt/β-catenin信号通路涉及机体的生长、发育以及细胞的增殖、凋亡等重要过程。已有研究表明Wnt/β-catenin通路异常激活与银屑病的发生密切相关[12-13]。本研究通过Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键分子，结果发现IL-22处理后，β-catenin和c-Myc蛋白表达水平均明显上调而激活Wnt/β-catenin通路，但是沉默SPINK7能够显著降低β-catenin和c-Myc的表达，表明SPINK7沉默可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，提示SPINK7沉默导致的对HaCaT细胞异常增殖和炎症反应的抑制作用可能与调控Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

综上所述，沉默SPINK7可有效抑制IL-22诱导HaCaT细胞异常增殖和炎症反应，该过程可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。了解SPINK7在银屑病发病机制和Wnt/β-catenin信号通路中的确切作用有望为寻常型银屑病的发病机制及治疗的研究提供一个新的思路，为本课题组进一步的研究奠定了基础。