养正合剂和粒细胞集落刺激因子对化疗后骨髓功能的影响①

寇小妮 朱 江

(陕西中医药大学附属医院肝病二科，咸阳 712000)

化疗始终是现阶段及将来很长一段时间内治疗恶性肿瘤的重要手段，对于控制病灶、缓解症状及延长生存期均有重要作用。然而，化疗药物在治疗多种肿瘤时常常伴有骨髓抑制、恶心呕吐、疲劳、腹泻、脱发等副作用，如广谱抗肿瘤药环磷酰胺(Cytoxan，CTX)属于细胞周期非特异性化疗药物，对增殖周期中各期细胞的杀灭作用突出，对粒细胞的影响更为明显，其典型毒副作用即为骨髓抑制(白细胞下降等)[1-2]。如何消除或减轻CTX等化疗药物所带来的毒副反应已成为临床上亟待攻克的难题。事实上，大部分骨髓抑制需药物治疗，临床上常给予集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)，但CSF致白血病的观点已得到证实，且其本身可引起多种不良反应，加之价格较高限制了其应用[3-4]；与此同时，祖国医药在减轻骨髓抑制等化疗毒副反应方面有独到优势[5]，近年来临床对中药配方制剂及单体成分作用的关注有增无减。现设计随机对照动物实验，以CTX致骨髓功能抑制小鼠模型，观察养正合剂和rhG-CSF对化疗后骨髓功能的影响，并研究其可能机制，以期为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康雌性C57BL/6小鼠共50只，雌雄各半，购自本市医科学院实验动物中心，6～8周龄，体重18～22 g。实验小鼠均饲养于12 h光明/12 h黑暗、20～26℃(温差不低于3℃)、湿度40%～70%且无特定病原体污染级别环境中，自由摄食与饮水，适应性饲养7 d后开始实验。小鼠均予以编号，建模后以随机数字表法分为5组：空白组、模型组、rhG-CSF组、养正合剂1组、养正合剂2组，各10只。本研究获动物实验伦理委员会批准。

1.1.2主要药品与仪器 注射用CTX购自上海华联制药有限公司；中药配方制剂养正合剂购自陕西步长制药有限公司(国药准字Z10970042)；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，rhG-CSF)购自北京双鹭药业股份有限公司(国药准字S19980010)；血清可溶性L-选择素(sL-selectin,sCD62L)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)ELISA试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司；免疫组化检测试剂盒购自丹麦DAKO公司；高速冷冻离心机购自湖南湘仪离心机仪器有限公司；光学显微镜购自日本Nikon公司；全自动血细胞分析仪购自日本SYSMEX公司。

1.2方法

1.2.1动物模型制备 参照文献[6]改良方法，以ip CTX方法制备骨髓功能抑制小鼠模型。模型组、rhG-CSF组、养正合剂组小鼠给予CTX生理盐水溶液40 mg/kg腹腔注射，1次/d，连续3 d，空白组腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2给药 空白组、模型组、rhG-CSF组、养正合剂1组、养正合剂2组于建模后(实验第4天)分别给予生理盐水(0.2 ml)、生理盐水(0.2 ml)、rhG-CSF(30 μg/kg)、养正合剂(4 mg/kg)及养正合剂(8 mg/kg)腹腔注射，1次/d，连续10 d(实验第4～14天)。每日密切观察小鼠生存状态，各组动物在第14天处死并完成各项检测。

1.2.3检测指标 ①将实验开始(化疗)前检测的指标作为基线水平，即d 0；分别于注射前及注射开始后第3、5、7、10、14天在眼底静脉丛采血50 μl，3 000 r/min 离心处理(离心半径15 cm)10 min后取血清标本，以ELISA法测定血清sCD62L、GM-CSF水平；并在离心处理前通过肝素抗凝后以全自动血液细胞分析仪测定外周血白细胞(white blood cell，WBC)、红细胞(red blood cell，RBC)、血红蛋白(hemoglobin，HGB)、中性粒细胞绝对数(absolute neutrophil number，ANC)及血小板(platelet，PLT)含量，继而明确各组外周血象下降与恢复情况。②脾指数测算，于末次给药后24 h处死小鼠取脾脏，除去表面结缔组织并用滤纸吸干表面血液，迅速称质量，并计算脾脏质量与体质量的比值，即为脾指数。③骨髓形态学分析，各组小鼠处死后取骨髓组织，切片后进行HE染色，显微镜下观察，并以图像分析软件测定骨髓腔面积中骨髓造血组织面积占比。

2 结果

2.1各组小鼠血清sCD62L、GM-CSF及外周血象变化比较 ①模型组、rhG-CSF组、养正合剂1组、养合剂2组CTX注射后第7天， 血清sCD62L、GM-CSF水平及外周血WBC、RBC、HGB、ANC、PLT明显降低， 与同组d0时相比差异有统计学意义(P<0.05)。②rhG-CSF组血清GM-CSF及外周血象各项指标在第10天、14天逐渐达到空白组水平，但血清sCD62L水平始终处于较高水平；养正合剂1组、养正合剂2组血清sCD62L水平在第10天、14天恢复至空白组水平，外周血象各项指标逐渐接近空白组水平。③第14天，血清sCD62L水平比较，rhG-CSF组>模型组>养正合剂1组>养正合剂2组；血清GM-CSF及外周血RBC、HGB、ANC、PLT比较，模型组<养正合剂1组<养正合剂2组

2.2各组小鼠脾指数及骨髓形态学分析结果比较 末次给药后24 h， rhG-CSF组、养正合剂1组、养正合剂2组脾指数均显著低于模型组，骨髓腔面积中骨髓造血组织面积占比显著高于模型组(P<0.05)；其中rhG-CSF组脾指数、骨髓腔面积中骨髓造血组织面积占比与空白组接近(P>0.05)，养正合剂2组脾指数明显低于养正合剂1组，骨髓腔面积中骨髓造血组织面积占比明显高于养正合剂1组(P<0.05)；但养正合剂1组、养正合剂2组与rhG-CSF组、空白组相比差异仍有统计学意义(P<0.05)。见图2，表1。

图1 各组小鼠血清sCD62L、GM-CSF及外周血象变化Fig.1 Changes of serum sCD62L, GM-CSF and peripheral hemogram in mice of each groupNote:A.Serum sCD62L;B.Serum GM-CSF;C.Peripheral blood WBC;D.Peripheral blood RBC;E.Peripheral blood HGB;F.Peripheral blood ANC;G.Peripheral blood PLT.

图2 各组小鼠骨髓形态学表现示例(HE染色，×400)Fig.2 Example of bone marrow morphology of mice in each group (HE staining,×400)Note:A.Blank group mice;B.Model group mice;C.rhG-CSF group mice;D.YangZheng compound mixture group 1 mice;E.YangZheng compound mixture group 2 mice.

表1 各组小鼠脾指数及骨髓形态学分析结果比较

3 讨论

骨髓抑制是化疗后严重且常见毒副反应之一，也是血液系统常见的、 可危及生命的毒性反应， 外周血中WBC为主的全血细胞下降为主要特征，WBC下降也是最常见、最早出现的异常情况，其次为PLT、RBC、HGB、ANC减少或下降，故骨髓抑制往往伴贫血、出血、抗感染能力下降等严重不良反应，可较大程度影响肿瘤治疗与预后[7-8]。对于化疗药物引起骨髓抑制的主要机制，当前文献大多支持的观点是药物对造血干细胞的损伤，同时损伤骨髓基质细胞的结构与功能[9]。为改善或避免化疗药物对骨髓功能的损害，长久以来临床进行了大量实验和研究，已证实CSF对于促进骨髓内造血细胞增殖并进入外周血有显著作用，可明显减轻或缓解化疗后的骨髓功能抑制，但也有报道指出CSF长期大量应用是增加白血病发病的危险因素，且其能刺激某些肿瘤细胞生长[10-11]；另有研究发现部分肿瘤患者化疗后骨髓造血细胞增殖本身即为活跃而非抑制状态，加之CSF价格较高，注射方式繁杂，也可引发不良反应(发热、骨骼酸痛等)，故临床对CSF使用存在一定质疑[12]。对于骨髓功能抑制，临床实际中常予以针对性治疗，较少预防，急需新药研发。

中医药在治疗骨髓抑制方面已被证实有一定疗效，现代药理学表明其机制主要包括促进造血祖细胞分化与增殖，激活造血生长因子、造血祖细胞因子表达，促进T淋巴细胞增殖及增强NK细胞活性等[13-14]。从中医学角度看，骨髓抑制归属于“虚劳-血虚”范畴，认为血的生成与脾紧密相关，即血液化生过程起初通过外界摄取食物，后经脾胃运化为生成血液的物质基础，而后化生为气血，故而脾胃化源是否充足直接影响气血充盈程度。有学者指出，对于化疗药物引起的气血亏虚，健脾益气法治疗能够培补脾胃之本，增强气血生化之源[15]。养正合剂主要由红参、黄芪、枸杞、女贞子、猪苓、茯苓6味中药制成，具有益气健脾、滋肝养肾的作用，早期研究已证实其能增强人体免疫力，用于治疗肿瘤患者化疗后引起的气阴两虚及缓解神疲乏力、少气懒言、五心烦热、口干咽燥等症状有显著效果[16-17]。

本研究中，除空白组外，各组CTX注射后第7天血清sCD62L明显升高，GM-CSF及外周血WBC、RBC、HGB、ANC、PLT降低，表明CTX可致骨髓功能抑制，且骨髓抑制状态下血清sCD62L表达升高，GM-CSF表达降低。为了进一步明确养正合剂改善骨髓功能抑制的作用，本实验以rhG-CSF干预为对照，对养正合剂1组、养正合剂2组小鼠给予小剂量、大剂量养正合剂干预，发现rhG-CSF组血清GM-CSF及外周血象各项指标在第10天、14天逐渐达到空白组水平，但血清sCD62L水平始终处于较高水平，进一步证实rhG-CSF促进粒细胞集落刺激因子产生，继而促进GM-CSF表达，改善外周血象；而养正合剂1组、养正合剂2组血清sCD62L水平在第10天、14天恢复至空白组水平，外周血象各项指标逐渐接近空白组水平，提示养正合剂可降低化疗后骨髓抑制状态小鼠血清sCD62L表达、改善外周血象。事实上，早期有研究指出骨髓抑制的重要原因之一在于骨髓内成熟造血细胞释放功能障碍，证实CD62L参与了粒细胞释放过程，即低表达CD62L的细胞易于进入外周血，反之，高表达CD62L的细胞则会粘附在血窦内皮细胞上阻碍其释放[18]。因此推测养正合剂可降低骨髓粒细胞CD62L表达，保护骨髓粒细胞系统从而调节骨髓粒细胞释放功能障碍，促进骨髓粒细胞释放入血，达到促进血细胞进入外周血液而恢复外周血象的目的，但确切机制有待进一步阐明。需指出的是，第14天，血清sCD62L水平rhG-CSF组>模型组>养正合剂1组>养正合剂2组，GM-CSF及RBC、HGB、ANC、PLT水平模型组<养正合剂1组<养正合剂2组

作为主要的外周免疫器官，脾脏是T、B细胞接受血源性刺激分化成熟并产生效应T细胞与浆细胞的主要部位，其功能状态直接决定了机体能否发挥正常的免疫功能，脾指数在一定程度上直接体现机体免疫功能状态，也被众多研究作为评估骨髓功能的实验指标[19-20]。本实验末次给药后24 h，rhG-CSF组、养正合剂1组、养正合剂2组脾指数均低于模型组，骨髓腔面积中骨髓造血组织面积占比高于模型组，提示rhG-CSF、养正合剂均可有效降低脾指数，增强小鼠免疫功能及骨髓造血功能。近期研究证实红参、黄芪配伍能促进造血、增强免疫功能[21]。本实验养正合剂2组小鼠脾指数、骨髓腔面积中骨髓造血组织面积占比改善效果优于养正合剂1组，但与rhG-CSF组、空白组相比仍有明显差异，表明大剂量养正合剂增强免疫功能、提升骨髓造血功能的效果优于小剂量，虽然二者的改善作用不如rhG-CSF强烈，但养正合剂促进粒细胞集落刺激因子产生的作用可能更缓和、持久，可能与两种药物作用机制、药效时间差异有关。陈凌波等[22]实验显示黄芪当归配伍可通过促进骨髓粒细胞释放来提高外周血象指标，作用缓和而持久，而rhG-CSF主要机制为促进骨髓粒细胞增殖，作用强烈，或可解释为何本实验养正合剂的改善作用不如rhG-CSF显著，但其具体原因仍需进一步探究。