淋巴细胞相关因子在帕金森病患者外周血中的表达和临床意义

董闽慧，马建华，王艳，刘璇

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种与年龄相关、病程不可逆的神经系统退行性疾病。PD的临床表现除运动功能障碍外，还可能合并认知功能障碍、情感障碍、睡眠障碍、嗅觉减退、感觉异常、自主神经功能紊乱等非运动症状[1]。目前相关研究认为PD 发病机制与年龄、氧化应激、感染、免疫炎症等因素相关[2]。免疫炎症因素成为近几年的研究热点，有证据表明神经炎症贯穿于PD 的发病及进展过程中，免疫异常不仅存在于中枢神经系统，也存在于外周免疫系统[3]。近年来对外周血淋巴细胞亚群的研究也使PD 的免疫背景受到重视，内涵更为广泛。相关研究表明非运动症状与神经免疫炎症相关性更高，如抑郁、疲劳和认知障碍[4]。白介素6(interleukin-6，IL-6) 及 白介素 10(interleukin-10，IL-10)为外周血可测得的细胞因子。IL-6是由活化的T淋巴细胞和成纤维细胞分泌的细胞因子，为炎性物质，可促进B淋巴细胞增殖、分泌抗体，国内外很多实验室对IL-6在PD发生和发展过程中的作用进行探讨，但尚未得到一致结论[5]。IL-10主要由人CD4+的T细胞分泌，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要功能是抑制和终止炎症反应，因而具有抗炎作用[6]。本次实验选择检测PD患者及健康人群血清IL-6、IL-10水平，并探索其与PD病程分期及认知、抑郁、焦虑、日常生活能力是否存在相关性，尝试探讨其在PD免疫炎症发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1月至5月新疆医科大学第一附属医院神经内科病房治疗的PD患者43例（PD组）,均符合英国帕金森病协会脑库临床诊断标准且征得患者及其家属同意参与、符合医学伦理学道德规范；排除口服非甾体抗炎药物及糖皮质激素患者，患继发性帕金森病、多系统萎缩等其他锥体外系疾病者，有反复头部外伤史、既往脑炎病史、肿瘤、大动脉炎、胶质病、血液病、严重肝肾疾病、甲状腺疾病等可能影响外周血淋巴细胞因子的免疫系统疾病患者。PD 组中，男 24 例,女 19 例；年龄 39～86岁，平均(64.72±10.37)岁；病程 0.1～15 年，平均(3.68±3.80)年。

选择同期体检健康人群41例作为对照组,排除遗传性疾病、神经系统病史及急慢性炎症、结缔组织疾病、恶性肿瘤、血液系统疾病、严重肝肾功能损害者。对照组中，男19例，女22例；年龄39～81岁，平均(61.56±12.61)岁。

1.2 方法

2 组均进行全面体格检查、常规血液检查和完整的病史采集。2 组均完成Hoehn&Yahr（H-Y）量表[7,8]、简易精神状态检查量表(mini-mental state examination，MMSE)[9]、蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment,MoCA)[10]、汉密尔顿抑郁量表（Hamilton depression scale，HAMD）[11]、汉密尔顿焦虑量表（Hamilton anxiety scale，HAMA）[12]，日常生活活动能力(activity of daily living，ADL)量表测评，且由同一名受过训练的临床医生进行评定。

外周静脉血样本采集：2 组均在早晨空腹状态下采集外周静脉血4 mL，不抗凝，静置2 h 后于低温高速离心机以转速1000 r/min离心20 min，分离血清，提取血清后立即放置于-80℃低温冰箱储存待测。

血清 IL-6、IL-10 水平检测：使用 IL-6、IL-10 酶联免疫试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。严格按照试剂盒说明书采用双抗体夹心法检测。具体步骤：标准品稀释与加样，在酶标包被板上除空白孔外分别将待测标本（每孔10 μL）或不同浓度标准品（每孔100 μL）加入相应孔中，除空白孔外每孔加入酶标试剂50 μL，温浴30 min，洗涤5 次后每孔加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL,轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min 后每孔加入终止液50μL，在加入终止液15 min 内，以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD）值。 通过CurveExpert1.3 分析软件绘制标准曲线求出血清IL-6、IL-10 水平。

1.3 统计学处理

使用SPSS21.0对数据进行统计分析，对服从正态分布的计量资料，使用（）描述，对不服从正态分布的计量资料，使用中位数和四分位数间距M（Q1,Q3）进行描述，组间比较使用t检验或非参数秩和检验。计数资料使用例数和百分率描述，组间比较使用χ2检验。指标关联性分析使用Spearman非参数检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般资料比较

2 组年龄、性别、民族、文化程度、吸烟、饮酒、高血压史、糖尿病史等基线资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05),具有良好的均衡性、可比性，见表1。

表1 2组一般资料比较

2.2 2组血清IL-6和IL-10水平比较

2组血清IL-6和IL-10水平为偏态分布数据，故使用非参数秩和检验探讨2组差异，结果显示PD组血清IL-6 和IL-10 水平均高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 2组血清IL-6和IL-10水平比较[ng/L，M(Q1,Q3)]

2.3 2组各项量表评分比较

2 组MMSE 评分、MOCA 评分差异均无统计学意义（P＞0.05）；但PD 组HAMD 评分和HAMA 评分均高于对照组（P＜0.05），ADL 评分低于对照组（P＜0.05），见表3。PD 组发生抑郁（HAMD 评分≥20 分）22 例（51.2%），发生焦虑（HAMA 评分≥14 分）30 例（69.8%），均高于对照组的5 例和10 例（P＜0.05），见表4。

表3 2组各项量表评分比较(分)

表4 2组抑郁、焦虑发生比较[例(%)]

2.4 PD组血清IL-6、IL-10水平与H-Y分期、各量表评分相关性分析

PD 组血清 IL-6、IL-10 水平 与 H-Y 分期、MMSE 评分、MOCA 评分、HAMD 评分、HAMA 评分、ADL 评分不相关（P＞0.05），见表5。

3 讨论

PD是导致神经元进行性死亡的不可治愈的神经退行性疾病。PD的发病率不论男女都随着年龄的增长而增加，总体发病率为17/100 000人[13]，发病率较高。目前临床工作中对于PD患者诊断主要依靠临床表现、药物试验性治疗及正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射断层扫描（SPECT）、放射性核素检测。因发病早期临床症状不典型，PET、SPECT 价格昂贵，并且难以获得活检PD的病理诊断而使PD患者的临床诊断及治疗处于不利地位，故可用于检测疾病不同阶段的易测量、可重复且不受人群的广泛变化和外部因素影响的指标是有临床价值的[14]。所以，在外周血中寻找可临床检测、易获取结果、可重复、价格合适的生物学标记物在临床工作中非常重要。

表5 PD组血清IL-6、IL-10 水平与H-Y 分期、各量表评分相关性分析

本次试验中选择血清IL-6、IL-10 因子进行检测，结果显示PD 患者外周血血清IL-6、IL-10 水平均显著高于对照组（P＜0.05），提示PD 患者体内存在炎症反应，PD 的发生发展可能与患者自身免疫系统失调所导致的炎症因子水平异常相关。IL-6主要由单核巨噬细胞分泌，属于炎症介质，可促进B细胞增殖和分泌抗体，增强NK细胞活性，目前多项研究[14-16]认为IL-6在PD患者外周血中的表达水平增高。IL-10主要由Th2细胞分泌，具有抗炎和免疫抑制作用，主要表现为抑制T淋巴细胞及巨噬细胞分泌促炎性因子，并抑制单核巨噬细胞的活化[17，18]，抑制和终止炎症反应,并通过抑制IL-2、IL-6、TNF-α的产生而抑制CD4+T细胞活性，继而起到直接抑制T细胞相关的致炎作用，可认为是PD患者的保护性因素。在本次试验中，血清IL-6、IL-10水平在PD患者中表现出相同的增高趋势，考虑是PD患者发病过程中免疫炎症激活及抗炎、免疫抑制在同时起作用。

H-Y分期反映PD患者的病程进展情况并且大致评估患者运动症状严重程度，本次试验结果显示PD 患者外周血血清IL-6、IL-10 水平与H-Y 分期无关联性，考虑是免疫炎症因素贯穿整个PD 病程，与PD 本身相关，不受病程进展影响。日常生活能力也可间接反映PD 患者病情进展情况，与患者运动功能关系密切，本研究PD 患者外周血血清IL-6、IL-10 水平与ADL量表评分无关联性，显示PD 患者外周血血清IL-6、IL-10 水平可能与患者运动症状发生及发展关联性较低，考虑是PD 患者经药物干预治疗后可满足基本日常生活需求，另一方面，不能排除是因收集的PD 患者以轻中度病例较多、病程晚期病例较少造成的。

本次试验结果发现PD患者外周血血清IL-10、IL-6水平与认知、焦虑、抑郁没有相关性，但目前有相关研究发现PD相关疼痛、抑郁患者的外周血IL-6、IL-10水平较对照组显著升高[19-21]，认为外周血IL-6、IL-10 水平与PD 患者非运动症状关联性更高[22]。IL-6 通过增加神经元还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicoti-namide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化应激相关的超氧化物量，使γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）能神经元的保护作用减弱，介导年龄相关的额叶皮层和海马GABA 能中间神经元的缺失、认知功能减低，空间学习及记忆功能也受到影响，行为改变。故目前免疫炎症因素与PD患者非运动症状之间是否存在相关性仍需进一步探究。本次试验虽然未发现PD 患者血清IL-6、IL-10 水平与认知、焦虑、抑郁相关，但PD 组焦虑、抑郁发生率明显高于对照组，HAMD评分、HAMA 评分明显高于对照组，MMSE 评分达到轻度认知障碍水平，另外，MOCA 因存在汉族与少数民族对题目理解程度不同而使评分可靠性较低，且PD-MCI 的诊断标准前尚未完全统一[23]，故不可作为参考依据。

在免疫炎症机制中，中枢神经系统及外周炎症可能均对PD患者的发病进程产生影响，外周炎症细胞、炎症因子作用于神经元、脑内皮细胞和邻近小胶质细胞进而诱发脑内炎症[24]。且脑内增高的炎症因子可以通过血脑屏障（BBB）进入血液循环，可引起外周血炎症因子升高。因此，患者外周血血清炎症因子水平可以间接反映脑内炎性反应程度，可能有希望为临床诊断及治疗提供依据[25]。目前针对PD患者免疫炎症方面的抗炎治疗，仍处于研究阶段，尚未得出一致结论，其中流行病学研究表明长期使用非甾体抗炎药物布洛芬可降低患PD 的风险，故一些研究人员建议使用阿司匹林等非甾体抗炎药物来调节小胶质细胞的促炎抗炎机制[26]，这些结果支持炎症在PD 发病中的重要作用。但另一项meta分析[22]显示非甾体抗炎药的使用与PD发病风险无关，非甾体抗炎药的效力和累积使用没有在PD发病、病程进展中起关键作用。故本研究的意义在于可为今后PD患者是否可纳入外周血淋巴细胞相关因子IL-6、IL-10为诊断及治疗依据提供实验室研究基础。

在本试验中存在一定的局限性，如抗PD 药物对外周血炎症因子的影响未作具体分析；纳入试验的样本数偏小，不同H-Y分期人数分布不均，未对PD患者进行年龄阶段不同分组；未对PD患者MOCA、MMSE各部分减退程度进行评估及与PD病程进展进行相关性分析；纳入PD 患者时未对其震颤为主还是僵硬为主进行分组评估；因在PD 患者中行腰椎穿刺术后行脑脊液相关检查尚未普及，故无法使用外周血血清炎症因子水平确切评估脑内炎症情况。