食管癌早期发现和高危人群预警液体活检技术分析

徐瑞华，宋 昕，李恩民，魏梦霞，韩文莉，雷玲玲，赵学科，孟超龙，胡守佳，程 锟，王盼盼，钟 侃，胡景峰，王 伟，李欣然，杨苗苗，杨媛啧，许丽艳，王立东

(1. 郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室、省部共建食管癌防治国家重点实验室，河南 郑州 450052；2. 汕头大学医学院广东沿海潮汕地区癌症高发区分子生物学重点实验室，广东 汕头 515041)

食管癌是上消化道常见的恶性肿瘤，每年新发50万例食管癌患者中一半以上发生在中国[1-2]，患者的死亡率排在消化系统肿瘤的第2位[3]。食管癌早期无特异性症状，确诊时大多已达中晚期，5 a生存率仅约20%[4]，严重威胁着人们的健康。因此，食管癌的早期发现成了提高患者生存率、降低发病率和死亡率的关键。食管癌早期发现主要是指发现无症状癌前病变患者和早期浸润癌患者，并进行针对性个体化干预和治疗。食管癌色素内镜和靶向黏膜活检组织病理学检查是实现这一目标的关键技术，但是其筛查成本高，并需要由经验丰富的内镜医师操作。因此，这一方法很难在高发区无症状人群中进行大规模筛查及推广应用。目前，已发现的很多食管癌癌变相关分子改变可以不同程度反映在外周血[5]，利用液体活检技术首先确定高危人群，再进一步行色素内镜病理活检，将极大减少内镜筛查人数，提高针对性筛查效果，节约筛查成本。细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是食管癌相关抗原[6-7]，本研究正是基于这一思路研发食管癌早期发现液体活检技术并在高发区推广应用，为食管癌早期发现和液体活检技术优化组合提供证据，分析这些分子指标联合检测对食管癌早期发现和高危人群预警的意义。

1 材料与方法

1.1 样品的收集480例早期食管癌患者和480例健康志愿者的血清样本来自郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室1995年1月至2018年1月建立的样本库。480例经组织病理学证实的早期食管癌患者中，男228例、女252例，年龄48～81(58.5±6.4)岁，均未接受放、化疗治疗。早期食管癌患者纳入标准：经组织病理学证实为早期(0期+Ⅰ期)；术前均未进行放、化疗等其他治疗；血样在术前收集；未合并其他肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病等影响血清蛋白的疾病。480例健康志愿者中，男228例、女252例，年龄35～82(58.7±9.2)岁。

1.2 方法

1.2.1 血清肿瘤相关抗原自身抗体的检测 对以上血清标本进行检测，采用本实验室已经建立的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法检测肿瘤相关抗原自身抗体CYFRA21-1、PCNA、TGF-β1[8-9]，包被的3种肿瘤相关抗原自身抗体最终稀释浓度为0.5 μg/μL，血样稀释浓度为150，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG稀释浓度为15 000。在ELISA板孔中加入包被稀释液稀释过的肿瘤相关抗原自身抗体100 μL/孔，4 ℃静置过夜(>24 h)，再加入稀释后的食管癌患者和健康志愿者血清100 μL/孔，每个样品至少进行2次检查，37 ℃孵育。包被已知阳性的血清为阳性对照，包被缓冲液为阴性对照。加入稀释的辣过氧化物酶标记的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基联苯胺-过氧化氢尿素显色液，100 μL/孔，37 ℃避光反应，当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50 μL终止反应，并读取OD450值。血清自身抗体检测结果判定采用Scripps研究所判定方法确定截断值，此值以上的为阳性，反之为阴性[5,10]。

1.2.2 高发区无症状人群小规模验证 我们在河南省食管癌高发区林州市用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测试剂盒进行食管癌早期筛查，为532例无症状人群进行双盲血清学检测和色素内镜检查，其中男273例、女259例，年龄35～70(53.3±11.7)岁。

1.2.3 高发区无症状人群大规模推广应用 我们在广东省和福建省的食管癌高发区医院采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测试剂盒对当地的无症状人群进行早期食管癌筛查，2013年1月至2019年12月，共有10 890例无症状人群参与其中，其中男5 389例、女5 501例，年龄35～70(52.5±10.3)岁，对检测结果为阳性的高危人群进一步行色素内镜检查。

1.3 TNM分期及临床分期标准TNM分期采用国际食管癌TNM分期标准第6版，食管癌临床分期基于TNM分期，分为早期(0期和Ⅰ期)、中期(Ⅱ期和Ⅲ期)和晚期(Ⅳ期)。

2 结果

2.1 早期食管癌患者和健康志愿者血清3种肿瘤相关抗原自身抗体阳性率比较CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1在早期食管癌中的阳性率分别为27.71%、31.67%、35.83%，均高于健康志愿者(2.92%、2.92%、5.00%)，差异均有统计学意义(χ2=113.752，P<0.001；χ2=138.708，P<0.001；χ2=140.425，P<0.001)。见表1。

表1 早期食管癌患者和健康志愿者血清3种肿瘤相关抗原自身抗体阳性率比较 n(%)

2.2 不同肿瘤相关抗原自身抗体联合检测的临床诊断价值CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测的敏感性67.08%，特异性76.04%，约登指数0.43，最适用于食管癌的早期筛查。见表2、3。

表2 不同肿瘤相关抗原自身抗体联合检测在早期食管癌患者和健康志愿者中的阳性率 n(%)

表3 不同肿瘤相关抗原联合自身抗体检测用于食管癌诊断的敏感性、特异性、约登指数比较

2.3 高发区无症状人群小规模验证结果我们在河南省食管癌高发区林州市采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测试剂盒对532例高发区无症状人群筛查，发现阳性103例(19.36%)，色素内镜检查结果示48例不典型增生患者、19例早期食管癌患者、9例中晚期食管癌患者、27例正常食管黏膜者；阴性429例(80.64%)，色素内镜检查结果示11例不典型增生患者、2例早期食管癌患者、0例中晚期食管癌患者、416例正常食管黏膜者。高发区无症状人群小规模验证结果证实，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测液体活检技术的诊断效果与色素内镜检查结果相似。见表4。

表4 高发区无症状人群CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测和色素内镜检查结果比较 n(%)

2.4 高发区无症状人群大规模推广应用结果我们在广东省和福建省的三家医院采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测液体活检技术试剂盒对当地的无症状人群进行早期食管癌筛查，结果显示，参与的10 890例无症状人群中，发现高危人群(阳性)1 759例(16.51%)，对阳性人群进一步进行色素内镜检查发现812例(12.22%)不典型增生患者、215例(46.16%)早期食管癌患者、23例(1.31%)中晚期食管癌患者、709例(40.31%)正常食管黏膜者。

3 讨论

食管癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，5 a生存率仅15%左右，早诊、早防和早治是降低食管癌发病率和死亡率的关键[11]。随着医学相关研究的进步，王立东等[5]发现食管癌变是一个多阶段演进的过程，是遗传-环境-基因交互作用的复杂结果，建立高危人群分子分型和液体活检技术是实现食管癌早期发现的关键环节。

目前，食管癌诊断的金标准依然是胃镜黏膜病理活检，胃镜活检操作复杂、有创、成本高、接受程度低，不适合在食管癌高发区无症状人群大规模推广应用。我们的研究发现，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1这3种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管癌患者血清中表达远高于健康志愿者。对上述3种肿瘤相关抗原自身抗体进行联合检测发现，早期食管癌的阳性率远高于单一指标检测，3种指标联合检测敏感性67.08%、特异性76.04%、约登指数0.43。结果提示，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测液体活检技术可以用于食管癌的早期筛查。

我们用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测试剂盒在河南省食管癌高发区林州市进行小规模无症状人群早期食管癌筛查，为532例无症状人群进行双盲联合血清学检测和色素内镜检查，比较该联合液体活检技术与色素内镜检查的结果。液体活检技术发现高危人群(液体活检阳性)103例，色素内镜检查结果示不典型增生、早期食管癌、中晚期食管癌各占48例、19例、9例；液体活检阴性429例中，色素内镜检查结果示不典型增生、早期食管癌、中晚期食管癌分别为11例、2例、0例。结果提示，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测液体活检技术的效果与色素内镜检查相似，适合在食管癌高发区无症状人群进行推广应用。

2013年1月至2019年12月，我们在广东省和福建省食管癌高发区的三家医院，采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测液体活检技术试剂盒对当地的无症状人群进行食管癌早期筛查，共有10 890例无症状人群参与其中，共发现高危人群(液体活检阳性)1 759例(16.51%)，对检测阳性的人群进一步行色素内镜检查发现，其中不典型增生812例、早期食管癌215例、中晚期食管癌23例、正常食管黏膜709例，早期发现率较高。10 890例人群通过液体活检技术筛查后仅16.51%需要进行色素内镜检查，也就是说83.49%的人群无需再行色素内镜检查，这样以来不仅大大降低了检查成本，同时也提高了食管癌早期筛查的依从性和时效性。

综上所述，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1联合检测液体活检技术是食管癌早期发现和高危人群预警的有效方法，通过这一方法先锁定高危人群，再进行色素内镜检查，大大减少了内镜筛查的数量，降低了检查成本，具有明显的推广应用价值。