维氏气单胞菌分离鉴定及对杀菌剂的敏感性

王淑娴，刁菁，樊英，盖春蕾，宋爱环，吴海一，叶海斌

（山东省海洋生物研究院/山东省海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266104）

维氏气单胞菌亦被称为维罗纳气单胞菌，隶属气单胞菌科（Aeromonadaceae）、气单胞菌属（Aeromonas）。维氏气单胞菌由杂交群分类属DHG8/10，致病菌株多数属DHG8[1]。近年来不断有研究表明维氏气单胞菌是一种重要的水生生物病原菌，还能够引起人畜共患病，给水产养殖业造成严重经济损失，同时还会使人类产生肺炎、败血症以及食物中毒等病症。养殖模式的集约化以及养殖从业者对各种抗生素的不合理应用给淡水鱼类疾病的预防和控制带来极大的困难。2020 年山东某鲤鱼养殖场暴发了以腹部肿胀，肠道充血并伴有一定腹水为主要症状的疾病，造成了所养鲤鱼的大量死亡。该研究从濒死病鱼体内的肝、脾、肾、肠道中分离纯化得到一株疑似致病菌，并对该菌进行了鉴定、系统发育树分析和体外药敏性研究，旨在为养殖鲤鱼的疾病防治提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株分离：通过划线法从患病鲤鱼的肝、肾、脾、肠等内脏组织中分离得到一株优势菌，命名为S-1。

主要试剂和仪器：分离细菌所用胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）购自北京陆桥生物试剂有限公司，基因组DNA 提取试剂盒、PCR 反应所需PremixTaq DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司，引物由上海生工合成，药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，PCR 仪、核酸微量测定仪、凝胶成像系统购自日本Bio-Rad 公司，微量加样器购自Eppendorf 公司。

1.2 细菌基因组DNA 提取

在TSA 平板上划线接种细菌S-1，于细菌培养箱中28 ℃过夜培养，用接种环挑取少量细菌于EP管中，按照基因组DNA 提取试剂盒的说明，提取细菌S-1 的基因组，使用核酸微量测定仪检测核酸浓度，作为PCR 反应的模板。

1.3 分子生物学方法鉴定

采用一对通用引物，对细菌S-1 的16S rRNA序列进行测定。PCR 反应体系：Premix Taq 酶 25 μL；正向引物（27 f）1 μL；反向引物（1492r）1 μL；S-1 基因组 1 μL；灭菌超纯水 22 μL，共 50 μL 体系。PCR反应条件为：94 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 1 min，55 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 l min 30 s，30 个循环；72 ℃温育 10 min。吸取 6 μL 的 PCR 产物，经 1.0%琼脂糖凝胶电泳20 min，利用凝胶成像仪观察并拍照。剩余PCR 产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果登陆GenBank 进行BLast 比对，构建系统发育树。

1.4 药敏性检测

采用KB 纸片扩散法[2]测定细菌S-1 的药物敏感性。将纯化的菌液进行梯度稀释，利用平板计数法配制的菌液浓度为1.0×108CFU/mL。吸取100 μL菌液均匀涂布在TSA 平板上，用无菌镊子将各种抗生素药敏片轻轻贴在培养基表面，28 ℃恒温倒置过夜培养，测量抑菌圈直径，根据药敏试纸片抑菌范围解释标准，判断菌株对药物的敏感程度。

2 结果与分析

2.1 菌株形态特性及镜检观察

将细菌S-1 接种于TSA 培养基上过夜培养，形成圆形，中央微隆，边缘较整齐，浅黄色有芳香味的中等大小的菌落。经过革兰氏染色，可在显微镜下观察到革兰氏染色阴性，短杆状，两端钝圆或直平的小杆菌。

2.2 基因组DNA 含量测定

将1 μL 细菌S-1 的基因组DNA 加入核酸微量测定仪中，经检测得知所提取的基因组DNA 的浓度为 120 ng/μL，OD260/OD280 值为 1.82，说明DNA 纯度较高，可以作为PCR 反应的模板。

2.3 16S rRNA 基因序列分析与系统发育树的构建

测序结果显示细菌S-1 的16S rRNA 基因序列长度为1453 bp，将该基因序列在NCBI 网站上进行BLast 检索。比对结果显示该菌与产气单胞菌属的16S rRNA 基因序列聚为一群，从同源性较高的序列中选取典型的序列，包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、梭形芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、温和气单胞菌（A.sobria）、灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、鳗弧菌（V.anguillarum）、欧式弧菌（V.owensii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻胶弧菌（V.alginolyticus）的 16S rRNA 基因序列，利用MEGA 4.O 软件进行系统发育学分析，结果显示细菌S－1 与两株A.veronii（KY767536.1 和MN581681.1）聚合在一起（如图1 所示）。

根据细菌16S rRNA 基因序列分析以及系统发育树的构建，将细菌S-1 鉴定为维氏气单胞菌。

图1 根据分离菌株S-1 的16S rRNA 基因序列绘制的系统发育树

2.4 药敏试验结果

如表1 所示，该菌对氯霉素、庆大霉素、四环素、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢曲松、头孢唑林、头孢他啶、头孢呋辛、米诺环素、氧氟沙星、哌拉西林、丁胺卡那、复方新诺明等抗生素高度敏感，对多西环素、新霉素、头孢拉定、红霉素、麦迪霉素等药物中度敏感，对诺氟沙星、环丙沙星、羧苄西林、痢特灵、多粘菌素B、卡那霉素、苯唑西林、万古霉素、克林霉素、氨苄西林、青霉素等药物不敏感。

3 讨论

维氏气单胞菌作为一种引起人-兽-鱼共患病的病原菌，可导致多种水生生物发病，还可引起人类等哺乳动物感染罹患多种疾病。人们治疗时的不合理用药，致使该菌对多种抗生素产生了耐药性，给鱼类养殖造成了严重的经济损失，同时也给人类的公共卫生安全造成了严重的威胁[3]，为此，维氏气单胞菌越来越引起国内外学者的高度重视。

表1 细菌S-1 药敏试验结果

有研究者从患病淡水鱼类中成功分离到维氏气单胞菌，同时观察其肝、肾、脾、肠、脑、鳃等实质器官的病理组织学变化，结果表明患病鱼类因多个组织器官出现严重的病理变化而导致死亡[4-5]。还有研究者通过使用16S r DNA 的 RFLP-PCR 技术对患病的和健康的养殖虹鳟鱼进行研究，发现50 株菌株，其中维氏气单胞菌占22%[6]。该研究从患病鲤鱼中分离得到一株革兰氏阴性细菌（S-1），16S rRNA 基因片段序列分析结果显示，该菌的16S rRNA 基因序列与维氏气单胞菌16S rRNA 基因序列的同源性最高，达到99%以上。MEGA 4.0 构建的系统发育树显示，在系统发育树上该菌与维氏气单胞菌聚成一簇，鉴定该菌为维氏气单胞菌。

维氏气单胞菌对多种抗生素呈现出不同程度的耐药性，这与养殖过程中乱用抗生素有很大关系。并且由于维氏气单胞菌会导致人兽共患疾病，所以临床的抑菌必须引起人们足够的重视，合理选择用药，对于不同菌株选择不同敏感的药物进行治疗，防止盲目性的乱用药。该研究采用药敏纸片法检测了从患病鲤鱼分离得到的维氏气单胞菌菌株对30 种抗生素的体外敏感性。结果表明：该菌株对氯霉素、庆大霉素、四环素、头孢氨苄等14 种抗生素高度敏感，对多西环素、新霉素、头孢拉定、红霉素、麦迪霉素等11 种药物具有耐药性。维氏气单胞菌对抗生素的耐药性检测，可以为气单胞菌属细菌感染疾病的防治提供科学参考。