正交试验设计优选通脉软膏的辅料组成及其渗透性能与皮肤安全性研究

陈韵蓓，强文社，苗文亮，斯郎巴吉，斯郎格玛

(1.四川省骨科医院药学部，四川成都 610041；2.甘孜藏族自治州藏医院，四川康定 626000)

藏医理论认为人体生命活动由“隆”、“赤巴”、“培根”三种能量物质构成，由“隆”物质构成的脉被称为白脉[1]，著名藏医学家宇妥·云丹贡布的经典著作《四部医典》中就早有记载，藏医学认为白脉病主要由“隆”引起，又称“白痹”[2-3]. 表现为口眼歪斜、瘫痪、小便失禁，或肢体肿胀、萎缩、僵硬等一系列症状[3].白脉理论是颇具特色的藏医学独有理论，而与神经系统、骨关节等疾病相关的白脉病以及相应的白脉疗法在藏医学中则具有重要影响.

通脉方出自《四部医典》[4]，是藏医治疗白脉病的经典名方，由姜黄、佛手、肉豆蔻、甘松、藏茴香、干姜、甘草、藏菖蒲、花椒等藏药组成，具有舒筋活络，开窍通络的功效.作为国家级重点民族医院，该方在甘孜州藏医院临床应用已有20 余年，疗效确切，是我院国家级重点专科风湿科、内分泌科专科特色的集中体现，但前期用法为水调和药粉后外敷，难以准确控制剂量.本文采用正交试验设计通脉软膏辅料比例，使用HPLC 建立了姜黄素含量测定方法，同时开展体外经皮渗透试验，比较软膏剂和传统外敷用法的吸收差别，此外还进行了皮肤过敏性实验，以期为通脉软膏用于临床诊疗提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色谱仪，包括LPG-3400SDN 型泵、WPS -3000SL 型进样器、TCC- 3000SD 型柱温箱、DAD - 3000 型检测器以及Chromeleon 7 色谱处理软件(赛默飞世尔公司)；BT25S 型十万分之一分析天平、BS124S 型万分之一分析天平(赛多利斯公司)；TT -6D 透皮扩散仪(天津市正通科技公司).

1.1.2 药品与试剂

姜黄素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110823 -201706)；通脉软膏(自制，批号 20191213、20191216、20191217)；Strat -M 膜(美国 Merck Millipore 公司，批号 K6CA1022)；凡士林(重庆韦伯力扬科技有限公司，批号192482)；羊毛脂(广州李德化工有限公司，批号190911)；液体石蜡(成都市科龙化工试剂厂，批号2018091202)；色谱乙腈(FISHER 公司，批号188652).

1.1.3 动物

白色豚鼠，普通级，30 只，雌雄兼有，体重220 ～260 g.购自成都达硕生物科技有限公司，生产许可证号:SCXK(川)2015 -030.

1.2 方法

1.2.1 建立姜黄素的含量测定方法

(1)高效液相色谱分析条件 色谱柱:Thermo Hypersil GOLD C18，4.6 mm × 250.0 mm，5 μm；流动相为乙腈-4%冰乙酸溶液(48∶52)；流速1.0 mL/min，检测波长425 nm，柱温25 ℃.

(2)配制对照品溶液及线性关系考察 称取姜黄素对照品适量，精密称定后放入25 mL 容量瓶，加入乙醇定容，得0.3332 mg/mL 的姜黄素贮备液，精密吸取该贮备液1 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加入乙醇定容，得到姜黄素对照品溶液，浓度0.03332mg/mL.稀释后分别配成 0. 01666、0. 00833、0. 004165、0.002083、0.001041 mg/mL 浓度，进样 5 μL.

(3)供试品溶液的制备及缺姜黄样品溶液的制备取通脉软膏约1 g，精密称定，然后向其中加入乙醇15 mL，置50 ℃水浴中加热20 min，超声处理(功率150 W，频率40 kHz)20 min，放冷，置冰水浴中冷却5 min，过滤，滤液置50 mL 容量瓶中，剩余残渣置同一50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入乙醇15 mL，超声处理20 min，放冷，置冰水浴中冷却5 min，过滤，剩余残渣再同法处理1 次，收集滤液，加入乙醇至50 mL，采用0.22 μm 微孔滤膜过滤，收集续滤液即得. 用不含姜黄的处方制备阴性通脉软膏，再按上述方法制得缺姜黄样品溶液.

(4)专属性实验 进样供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5 μL.

(5)精密度实验 将“1.2.1(2)”项下0.03332 mg/mL 的姜黄素对照品溶液精密吸取5 μL 连续进样6 次.

(6)重复性实验 取本品约1 g，精密称定，并平行取6 份样品，按“1.2.1(3)”项下供试品溶液的制备方法制备供试品，每份供试品进样5 μL.

(7)稳定性实验 取本品约1 g，精密称定，按“1.2.1(3)”项下的方法制备，分别在 0、1.5、3、4.5、6、7.5、9 h 进样 5 μL.

(8)加样回收率 取已知含量的本品(批号:20191216)约0.5 g，平行取6 份样品，精密称定，分别加入0.35 mL“1.2.1(2)”项下的姜黄素对照品贮备液，按“1.2.1(3)”项下的方法分别制备并进样分析.

1.2.2 通脉软膏配方筛选

(1)配制通脉软膏 称取甘油、凡士林、液体石蜡、羊毛脂适量，加热后混合均匀，待放冷后加入药物，搅拌均匀，即得.

(2)测定粒度 取载玻片，在其上涂上样品，覆盖载玻片，平行制备三份，以《中国药典》2015 版四部中的粒度和粒度分布测定法测定，10 分为粒度最细腻的样品评分，与其比较得出其余样品评分[5].

(3)测定均匀度 在烧杯中放入适量样品后静置，观察并记录样品的沉降情况及颜色的均匀性，10分为最佳的样品评分，与其比较得出其余样品评分[5].

(4)优化通脉软膏配方

①选择因素水平 在前期文献调研及预试验基础上，选择羊毛脂(A)、液体石蜡(B)及凡士林(C)为正交试验设计的因素，采用L9(34)正交表，正交试验的水平因素见表1.

表1 正交试验水平因素表Table 1 Factor and level table

②评价指标及数据统计 均匀度评分与粒度评分相加为软膏的物理性状得分，并参考姜黄素含量考察配方，得分采用SPSS24.0 软件进行统计.

③验证试验按上述试验优化的方案制备通脉软膏共三批，检测相应指标.

1.2.3 体外经皮吸收试验

将软膏均匀涂抹在Strat-M 膜上，将Strat-M 膜夹在透皮杯的释放池与接收池之间，用配套夹子夹紧，向接收池中放入磁转子，以生理盐水作为接收液，将其加至刻度线，设定仪器的搅拌速度为600 r/min，由于是透皮吸收试验，设定接收液的温度为(37 ±0.1) ℃，设定 6 个时间点:1、2、4、8、12、24 h，在每个时间点取2 mL 接收液，并用生理盐水补足，将取出的透皮液0.45 μm 微孔滤膜过滤后进样，检测其中姜黄素含量，另将处方药粉加水调成稠膏状，同法进行实验以检测传统外敷用法的透皮吸收参数.按下式计算透皮率[6].

上式中，一定时间内累积的透皮量为Qn，在第n个时间点时接受液的浓度为Cn，接收池的体积为V，在第i 个时间点时取样样品的浓度为Ci，取样时的取样体积为Vo，一定时间内累积的透皮率为Vn，供试品中姜黄素总的含量为M[6-7].

1.2.4 通脉软膏皮肤过敏性试验

将豚鼠按随机分层法分为空白组、阳性药组、通脉软膏组，每组10 只.实验前将豚鼠背部左右两侧脱毛，脱毛面积约9 cm2.实验第1d 将药物涂抹在动物的左侧脱毛区，空白组涂抹空白基质，阳性药组涂抹2，4 -二硝基氯化苯，通脉软膏组涂抹通脉软膏，将抹药处覆盖纱布并固定开始致敏，6 h 后除去药物.实验第7、14 d，分别将动物背部左侧脱毛区域的毛发剃除干净后，采用同样方法在相同部位致敏给药1 次，同样保持6 h 致敏时间. 实验第28 d，在豚鼠未抹药的背部右侧脱毛区，以同样方法敷药6 h 以激发[6，8].

2，4 -二硝基氯化苯的药物浓度为1%，其激发浓度为0.1%，给药量为0.2 mL/只，通脉软膏按成人用量换算，给药剂量为每100 cm2皮肤涂抹1.2 g/kg，空白组涂抹等量基质.

各组动物分别在激发后24、48、72 h 观察记录皮肤红斑和水肿情况，按照皮肤过敏评级表(表2)进行评分[8]，并按下式计算各组别分值:分值＝(红斑评级分数+水肿评级分数)/该组动物数，以及致敏率:致敏率＝(过敏反应阳性数/该组动物数) ×100%.按药物致敏性分类表(表3)进行评价.各组别在每个时间点的观察均拍照记录，实验前后测定各组动物体重[6，8].

表2 皮肤过敏评级标准表Table 2 Skin allergy rating scale table

表3 药物致敏性评级标准表Table 3 Drug sensitization rating scale table

2 结果

2.1 姜黄素含量测定方法建立

2.1.1 对照品溶液制备及线性关系考察

纵坐标为峰面积(Y)，横坐标为姜黄素进样量(X)，得出姜黄素的线性关系如下:Y＝144. 62X-0.1836(r＝0.9998)，说明峰面积与姜黄素进样量在0.0052 μg 到 0.1666 μg 之间时具有较好的线性关系.

2.1.2 专属性实验

姜黄素峰明显，阴性供试品在相应的时间无干扰，见图1.

图1 高效液相色谱图Fig. 1 HPLC

2.1.3 精密度实验

经过计算RSD(姜黄素峰面积)为1.09%，仪器精密度较好.

2.1.4 重复性实验

经过计算RSD(姜黄素的平均含量)为3.80%，含量均值为0.2362 mg/g，本方法具备较好重复性.

2.1.5 稳定性实验

以姜黄素峰面积计算RSD 为0.53%，表明样品在9 h 内稳定.

2.1.6 加样回收率

姜黄素的平均回收率为99. 32%，RSD 为 2.53%，本方法加样回收率能满足要求.

2.2 通脉软膏配方筛选

2.2.1 正交试验评价指标及数据统计

由表4 可知，通脉软膏的性状受不同的基质配方的影响比较大，而姜黄素的含量则受影响较小，三个因素中软膏性质受影响最大的是凡士林，羊毛脂稍小，液体石蜡最小，A2B3C2为最佳配方，由表5 可知，凡士林及羊毛脂用量对结果有显著性影响，液体石蜡没有显著性影响.

表4 正交试验结果Table 4 Orthogonal test results

表5 方差分析表Table 5 Variance analysis table

2.2.2 验证试验

结果显示，正交试验筛选出的配方稳定可行，见表6.

表6 验证试验结果(n ＝3)Table 6 Verification test results (n ＝3)

2.3 体外经皮吸收试验

由SPSS22.0 软件对两组数据进行t检验得出，通脉软膏在每个时间点的透皮量和透皮率与外敷药粉法比较均有显著性差异(P＜0.05)，以累计透皮率Ln 对时间 t 作图，见表 7，图 2.

表7 累计透皮量、透皮率(，n ＝3)Table 7 Cumulative transdermal volume and rate (，n ＝ 3)

表7 累计透皮量、透皮率(，n ＝3)Table 7 Cumulative transdermal volume and rate (，n ＝ 3)

注:软膏剂与外敷药粉法比较P*＜0.05

软膏剂外敷药粉法时间点(h)累计透皮量(mg/g) 累计透皮率(%) RSD(%) 累计透皮量(mg/g) 累计透皮率(%) RSD(%)1 0.0017 ± 2.2 × 10 -4* 0.71 ± 0.12* 0.88 0.0007 ± 2.0 × 10 -4 0.30 ± 0.12 1.15 2 0.0078 ± 6.3 × 10 -4* 3.28 ± 0.22* 1.29 0.0034 ± 6.7 × 10 -3 1.45 ± 0.19 1.69 4 0.0169 ± 2.4 × 10 -3* 7.10 ± 0.31* 1.55 0.0071 ± 2.1 × 10 -3 3.02 ± 0.29 1.92 8 0.0259 ± 3.1 × 10 -3* 10.88 ± 0.61* 1.71 0.0117 ± 3.2 × 10 -3 4.98 ± 0.48 1.48 12 0.0330 ± 3.7 × 10 -3* 13.87 ± 0.92* 1.69 0.0151 ± 4.4 × 10 -3 6.43 ± 0.61 2.22 24 0.0411 ± 4.2 × 10 -3* 17.27 ± 1.21* 2.66 0.0182 ± 2.6 × 10 -3 7.74 ± 0.58 2.51

图2 累计透皮率折线图Fig.2 Line chart ofcumulative transdermal rate

用不同方程进行拟合，结果显示通脉软膏及外敷药粉法中姜黄素的体外经皮吸收过程均符合Higuchi方程，见表8.

表8 累计透皮率拟合方程Table 8 Fitting equation of cumulative transdermal rate

2.4 通脉软膏皮肤过敏性试验

结果显示，阳性药组在三个时间点致敏率均为100%，为极度致敏性，空白组与通脉软膏组均未观察到过敏反应，见表9. 各组豚鼠体重均有不同程度增加，见表10.

表9 皮肤过敏评级结果Table 9 Skin allergy rating results

表10 豚鼠体重变化表()Table 10 Weight changes of guinea pigs()

表10 豚鼠体重变化表()Table 10 Weight changes of guinea pigs()

组别 动物(只)体重(g)实验前 第1 周 第2 周 第3 周 第4 周空白组 10 228.3 ±23.1 243.2 ±29.7 324.6 ±32.9 342.7 ±40.4 286.7 ±28.3阳性药组 10 235.7 ±30.6 251.0 ±40.2 290.1 ±30.6 312.6 ±33.2 349.5 ±24.6通脉软膏组 10 234.4 ±30.4 250.3 ±20.5 289.0 ±19.2 327.5 ±22.6 356.0 ±26.3

3 讨论

通脉软膏主要由药物和基质成分组成，制备软膏容易出现的问题是软膏放置后易分层，尤其是通脉软膏这类药粉直接入药的制备方式，因此需要从配方入手再辅以充分的搅拌，才能避免出现分层[9]. 本文选择液体石蜡、凡士林为基质的主要成分[10]，将药粉加入基质后均匀性较好，膏体性状较佳，但是内容物粒度欠佳，长期放置后仍然会在底部出现少许沉淀. 为了解决此问题，我们结合文献筛选了数种基质成分[11-12]，最终发现羊毛脂能较好地改善膏体的最终物性，于是在基质中加入羊毛脂后再加入药粉，能得到均匀细腻的软膏，也可以在长期放置过程中保持较好的性质.

本文结合相关文献及预实验[13]，发现用乙醇多次水浴加热+超声处理的方式制备通脉软膏供试品，其中的有效成分可以较多地保留.在姜黄素的色谱条件考察中，得出乙腈-4%冰乙酸溶液(48∶52)为流动相时，姜黄素峰具备较好的分离效果[14-15]，同时，Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱具有更好的峰形[16].

由表7、图2 可知，从1 h 开始的每个时间点，通脉软膏的累计透皮量均较外敷药粉法为高，而两药的姜黄素含量大致相当，因此至24 h，通脉软膏的累计透皮率已达17.27%，超出外敷用法较多，推测是由于软膏由亲脂性基质制成，对药物经皮吸收有促进作用[17]，而传统外敷用法则是将药粉加水调成一定稠度敷在皮肤表面，药粉未在介质中分散均匀，也缺乏促进药物渗透的基质.本文采用了人工仿生膜Strat-M，这是一种模仿人体皮肤开发的仿生膜，在透皮吸收的表现上，它更接近真实的人体皮肤，同时，该仿生膜的数据重现性更是优于手工制作的各种动物皮肤[6，18].同时，通过过敏性试验，我们发现通脉软膏反复用药后，不会引起皮肤的过敏反应. 通脉软膏的研究，对于少数民族地区患者用药的安全性和有效性具有重要的意义，本研究为其推广应用奠定了基础.