护肾安胶囊中丹参酮含量测定及主药薄层鉴别

王黎荣　王旭超　田海　王吉东　徐久春

摘 要：采用薄层色谱法对护肾安胶囊中的丹参、黄芪、黄芩进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）对丹参酮ⅡA含量进行定量检测.丹参酮ⅡA在进样量（0.008 27～0.165 40μg）范围内，线性关系良好（R2=1.000 0）;平均回收率为97.12%，RSD为1.38%.本方法操作简单便捷，结果准确可靠，适用于护肾安胶囊中丹参、黄芪、黄芩的薄层鉴别及丹参酮ⅡA的含量测定.

关键词：TLC;丹参酮ⅡA;HPLC;含量测定

[中图分类号]R917   [文献标志码]A

Determination of Tanshinone in Hushen'an Capsules andTLC Identification of Main Medicines

WANG Lirong1，WANG Xuchao2，TIANG Hai2，WANG Jidong2，XU Jiuchun2

（1.Pharmacy Department，The People's Hospital of Lingao County，Sanya 571800，China;Collegeof Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

Abstract：TLC method for the main ingredient in compound kidney capsule qualitative identification of salvia miltiorrhiza and radix astragali，radix scutellariae;Using high performance liquid chromatography（HPLC） method was carried out on the main content of tanshinone type ⅡA in medicine salvia miltiorrhiza quantitative detection.Tanshinone type ⅡA in sample quantity（0.008 27～0.165 40μg） range，good linear relationship （r=1.000 0）;The average recovery was 97.12%，RSD was 1.38%.This method is simple and convenient operation，accurate，reliable and suitable for compound interest of salvia miltiorrhiza and radix astragali，radix scutellariae in renal capsule thin layer identification and determination of the content of tanshinone type ⅡA.

Key words：TLC;tanshinone ⅡA;HPLC;determination

护肾安为一经验处方，临床上对肾脏病轻中度蛋白尿、肾小球肾炎等慢性疾病具有较好的治疗效果，多年临床应用证明其疗效稳定可靠.该处方由丹参、川芎、黄芪、黄芩、姜黄等10味药材组成，具有扶正固本、补肾安神、标本兼顾的作用.丹参是护肾安胶囊中的主药，它的主要成分丹参酮ⅡA有显著抗炎作用，含量较高，是丹参药材含量测定的控制指标.本研究将对处方中主要药材丹参、黄芪、黄芩进行薄层鉴别，建立主要活性成分丹参酮ⅡA含量测定方法，为最终质量标准的确立提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

试药及试剂 丹参酮ⅡA对照品（110768-201719），丹参对照药材（120923-201614），黄芪甲苷对照品（110781-201714），黄芩苷对照品（110715-201718），以上均购于中国食品药品检定研究院.甲醇（20190308，Sigma），纯化水（20191212，市售），试剂均为分析纯.

仪器 日本岛津高效液相色谱仪（N2000型，日本），分析天平（Sartorius BPZ110，上海），超声波清洗仪（KQ2200，佛山），数显鼓风干燥箱（GZX-9000，上海），电热恒温水浴锅（DK-S26，上海），薄层色谱摄影仪（GoodSee-Ⅱ，北京），紫外分光光度计（UV-2450，上海），硅胶G薄层板（10 cm×10 cm×0.3 mm，青岛）.

1.2 丹参的薄层鉴别

1.2.1 溶液的制备

（1）取护肾安胶囊内容物约1 g，研细，加25 mL乙醚，超声20  min，过滤，重复操作2次，挥干溶剂，残渣加乙酸乙酯2 mL溶解，得供试品溶液.

（2）取丹参对照药材0.1 g，按供试品处理方法进行操作，得对照药材溶液.

（3）取对照品丹参酮ⅡA适量，加入乙酸乙酯配制成濃度为0.01 mg/mL的对照品溶液.

（4）取处方中不含丹参的其他所有药材，按照护肾安胶囊工艺流程制备成阴性对照品，取1 g，按供试品处理方法步骤进行操作，得阴性对照品溶液.

1.2.2 色谱条件

薄层色谱法[1]试验.吸取上述四种溶液各5 μL，在同一块硅胶G薄层板上点样，以苯-乙酸乙酯（19∶1）作为展开剂（预饱和0.5 h），展开，取出，晾干，在日光灯下进行观察，结果见图1.

1.3 黄芪的薄层鉴别

1.3.1 溶液的制备

取护肾安胶囊内容物2 g，研细，加甲醇30 mL，加热回流2 h，过滤，挥干溶剂;往残渣加水20 mL，微热使溶解，放冷，然后用乙醚连续萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液.用正丁醇（水饱合）振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液.继续用氨试液提取2次，每次30 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，最后残渣用甲醇2 mL溶解.10 ℃以下放置过夜，分层，取下层溶液作为供试品溶液.取对照品黄芪甲苷适量，加甲醇制备成浓度为0.01 mg/mL的对照品溶液.取处方中不含黄芪的其他所有药材，按照护肾安胶囊工艺流程制备成阴性对照品，取1 g按供试品处理方法步骤进行操作，得阴性对照品溶液.[2-4]

1.3.2 色谱条件

薄层色谱法试验.吸取上述三种溶液各2 μL，在同一块硅胶G薄层板上点样，用三氯甲烷∶甲醇∶水=13∶7∶2的混合液作为展开剂，展开，取出，晾干，在365 nm的紫外灯下进行观察，结果见图2.

1.4 黄芩的薄层鉴别

溶液的制备 取护肾安胶囊内容物约1 g，研细，加人30 mL乙酸乙酯∶甲醇=3∶1的混合溶液，加热回流30 min，放冷，滤过，挥干，残渣加甲醇2.5 mL使溶解，离心，取上清液做为供试品溶液.取对照品黄芩苷1 mg，加甲醇制备成浓度为0.02 mg/mL的对照品溶液.取处方中不含黄芩的其他所有药材，按照护肾安胶囊工艺流程制备成阴性对照品，取1 g，按供试品处理方法步骤进行操作，得阴性对照品溶液.[3-5]

色谱条件 薄层色谱法试验.吸取上述三种溶液各2 μL，在同一块硅胶G薄层板上点样，用甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸=12∶4∶1.5∶3的混合液作为展开剂（展开剂需预饱和0.5 h），展开，取出，晾干，用10%硫酸乙醇混合液作为显色剂显色，加热至斑点清晰，在日光灯下进行观察.结果见图3.

1.5 丹参酮ⅡA含量测定

丹参为处方中主药之一，主要含有隐丹参酮、丹参酮类化合物、丹酚酸类化合物等成分，其中丹参类化合物具有较强的抗炎作用，含量较高，对临床安全用藥具有指导意义.本研究以丹参类化合物丹参酮ⅡA作为评价指标，对护肾安胶囊的含量进行测定.[6]

色谱条件 采用SHMASZU C18（250×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-水（80∶20）作为流动相，检测波长为270 nm，柱温为室温.理论板数按丹参酮ⅡA峰计算，不低于5 000.

溶液的制备 取丹参酮ⅡA对照品，精密称定，加甲醇制备成浓度为0.025 mg/mL的溶液，用微孔滤膜（0.20 μm）过滤，取续滤液作为对照品溶液.取护肾安胶囊内容物2 g，按“丹参薄层鉴别方法”中供试品的处理方法进行操作，干燥后残渣加入液相的流动相使其溶解，定容到25 mL，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液.按“丹参薄层鉴别方法”中阴性的处理方法进行操作，干燥后残渣加液相的流动相溶解，定容到25 mL，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为阴性对照溶液，即得.[7]

专属性实验 取阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液，依次按色谱条件进针，结果见图4-6.

线性试验 分别取丹参酮ⅡA对照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，依次注入高效液相色谱仪，测得峰面积为纵坐标，以丹参酮ⅡA对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线.

精密度试验 吸取同一供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复5次，按色谱峰面积积分值计.

重现性试验 取同一批号胶囊剂，共5份，制备成供试品溶液，分别进样测定.

稳定性试验 取供试品溶液，分别于0，6，12，18，24 h测定，按色谱峰面积积分值为指标，进样量为5 μL.

回收率试验 取同法测定已知含量的供试品5份，精密加入对照品测定，计算回收率.

样品的含量测定 取中试实验生产的三批样品，制备成供试品溶液，测定含量.

2 结果与分析

2.1 丹参、黄芪、黄芩薄层鉴别结果

丹参的薄层鉴别结果见图1.图1的实验结果显示，在与对照药材和对照品色谱图对应的位置上，供试品色谱图表现出相同颜色的斑点，阴性无干扰，故将其列入标准正文.

黄芪薄层鉴别结果见图2.图2的实验结果显示，与对照品色谱图对应的位置上，供试品色谱图显相同的橙黄色荧光斑点，阴性无干扰，故

1.供试品 2.对照药材 3.对照品 4.阴性对照  1.供试品 2.对照品 3.阴性对照    1.供试品 2.对照品 3.阴性对照图1 丹参的薄层鉴别图2 黄芪的薄层鉴别图3 黄芩的薄层鉴别

将其列入标准正文.

黄芩薄层鉴别结果见图3.图3的实验结果显示：供试品色谱图上，与对照品色谱图相应的位置显现出相同颜色的斑点，阴性无干扰，故将其列入标准正文.

2.2 丹参酮ⅡA含量测定

丹参酮ⅡA含量测定系列实验结果见图4-6. 图5的实验结果显示，丹参酮ⅡA在33 min处出现色谱峰，供试品溶液在相同时间出现色谱峰，阴性对照品的色谱图在丹参酮ⅡA相应的保留时间附近无干扰峰，证明复方中其他成分在该色谱条件下对丹参酮ⅡA的色谱峰无影响.样品的平均含量为0.27 mg/粒，考虑到药材产地、储存、运输及自然条件变化对丹参药材质量的影响，暂定本品每粒胶囊含丹参以丹参酮ⅡA（C33H40O15）不得少于0.20 mg.

依法绘制标准曲线，得回归方程Y=4 912.2X-1.305 6.进样量（0.008 27～0.165 40 μg）范围内，线性关系良好（R2=1.000 0）.供试品溶液按精密度检测方法进样检测，峰面积RSD=0.40%，证明仪器精密度良好，数据可靠.供试品溶液按重现性检测方法进样检测，峰面积RSD=1.17%，证明本法重现性良好.不同取样点供试品溶液峰面积RSD=0.57%，证明供试品溶液至少24 h内稳定.平均回收率为98.52%，RSD为1.38%，证明此方法可行.