一种多菌灵酶联免疫快速检测方法的建立

蒋文慧 吴小胜 崔 娜 张 瑜 彭正学 崔海峰 万宇平

(1.浙江省杭州市人民检察院，浙江 杭州 310012；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；3.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京 102206；4.北京望尔生物技术有限公司，北京 102206)

多菌灵(carbendazim)即N-(2-苯并吡唑基)氨基甲酸甲酯，属于苯并吡唑类，是一种病害防治杀菌剂，被广泛应用于农作物。然而施用多菌灵的目标物会长期残留该药物，人、畜食用后，会引起头晕、恶心、呕吐、抽搐等一系列中毒症状[1-2]。

GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了果蔬、茶叶中多菌灵的最大残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)范围为：0.02～5.00 mg/kg。目前中国的检测标准有：GB/T 5009.188—2003《蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定》、GB/T 23380—2009《水果、蔬菜中多菌灵残留的测定 高效液相色谱法》、SN/T 3650—2013《药用植物中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵残留量的测定 液相色谱—质谱/质谱法》、SN/T 0162—2011《出口水果中甲基硫菌灵、硫菌灵、多菌灵、苯菌灵、噻菌灵残留量的检测方法 高效液相色谱法》、SN/T 1753—2016《出口浓缩果汁中甲基硫菌灵、噻菌灵、多菌灵和2-氨基苯并咪唑残留量的测定 液相色谱—质谱/质谱法》、SN/T 0220—2016《出口水果中多菌灵残留量的检测方法》、NY/T 1680—2009《蔬菜水果中多菌灵等4种苯并咪唑类农药残留量的测定 高效液相色谱法》、NY/T 1453—2007《蔬菜及水果中多菌灵等16种农药残留测定 液相色谱—质谱—质谱联用法》。上述标准均为仪器分析法，同时，通过查阅文献发现，前人研究多菌灵检测方法较多地偏重仪器方法，已报道的仪器方法有：超高效液相色谱法[3]、QuEChERS—高效液相色谱法[4-5]、液相色谱—质谱/质谱法[6]、紫外分光光度法[7]、液相色谱法[8-9]、高效液相色谱法[10-11]、SERS法[12]等，分析对象主要为蔬菜、水果。此外，也有报道[13-14]利用酶联免疫法快速检测多菌灵的残留量，但分析对象为土壤和水，目前尚未检索到农产品中检测多菌灵残留量的快速检测方法。而且仪器分析法成本高、步骤复杂，对检测人员有较高的技术要求，不便于基层实验室和中小型生产企业实施检测。因此，研究拟采用酶联免疫吸附法对烟叶、苹果、白菜、茶叶中多菌灵残留量进行检测，以期提供一种成本低、效果好的方法，为农药残留监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

多菌灵、噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑标准品：纯度≥95%，北京标准物质研究中心；

牛血清白蛋白：纯度≥98%，美国Sigma公司；

卵清蛋白：纯度≥98%，美国Sigma公司；

三氟乙酸、三氟乙酸酐、硝酸铵、氢氧化钠、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化锡、碳二亚胺、石油醚、硫化铵、二甲基甲酰胺、碳酸钾：分析纯，北京百欣试剂公司；

果蔬、茶叶、烟叶：市售；

Balb/c小鼠：斯贝福(北京)生物技术有限公司；

单克隆杂交瘤细胞株：实验室自制；

酶标仪：MK3型，上海雷勃分析仪器有限公司。

1.2 抗原制备

1.2.1 半抗原制备 取三氟乙酸20 mL，加三氟乙酸酐2 mL，冰水浴至0 ℃，加硝酸铵0.5 g，搅拌1 h，加入含多菌灵1.0 g的三氟乙酸溶液，继续搅拌反应2 h。停止搅拌，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加200 mL二氯甲烷萃取，加水300 mL，充分搅拌，转入分液漏斗中，静置30 min，分层，分去上层水相，所得二氯甲烷溶液，旋蒸(40 ℃)，50 mL乙醚打浆，得到化合物a 0.76 g，收率67%[15]。在上述三氟乙酸和三氟乙酸酐体系下，用硝酸铵对多菌灵进行硝化反应，在苯环上引入硝基，萃取前进行中和，便于萃取。1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ：8.31(1H，dd，J=1.616，J=1.239)，7.69(1H，dd，J=8.716，J=1.616)，7.64(1H，dd，J=8.716，J=1.239)，3.85(3H，s)。

取化合物a 0.7 g用乙醇溶解，加含0.43 g氯化锡的水溶液10 mL，通入氮气，加热回流反应3 h；旋蒸(60 ℃)、除去乙醇，加水200 mL，加乙酸乙酯100 mL，充分搅拌，静置，分去水相，有机相旋蒸(55 ℃)以除去大部分乙酸乙酯，利用石油醚—乙酸乙酯(V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶1)对其进行洗脱分离，得到b产物(半抗原化合物)0.54 g，收率为83%。1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ：3.79(3H，s)，6.27(2H，s)，6.90(1H，dd，J=2.225，J=1.850)，6.46(1H，dd，J=8.422，J=2.225)，7.34(1H，dd，J=8.422，J=1.850)，5.00(1H，s)，9.15(1H，s)。上述产物经核磁共振氢谱测定，在化学位移δ=6.27处存在苯环上芳香胺的共振吸收峰，说明半抗原合成成功。多菌灵半抗原合成路线见图1。

1.2.2 免疫原制备 称取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，得到溶液A；用0.2 mL H2O 溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺各30 mg，加入至溶液A中，搅拌30 min；取15 mg半抗原，溶解于1 mL 二甲基甲酰胺溶液中，然后缓慢加入到溶液A中溶解，搅拌24 h。透析后分装，-20 ℃保存。

1.2.3 包被原制备 称取卵清蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，得到溶液B；用0.2 mL H2O 溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺各30 mg，加入至溶液B中，搅拌30 min；取13 mg半抗原，溶解于1 mL 二甲基甲酰胺中，然后缓慢加入到溶液B中溶解，搅拌24 h。透析后分装，-20 ℃保存。

图1 多菌灵半抗原合成Figure 1 Synthesis of carbendazim hapten

1.3 酶标记抗抗体制备

利用1.2得到的免疫原免疫Balb/c，制备杂交瘤细胞株，纯化出多菌灵单克隆抗体[16]，免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体[17]，再用辣根过氧化物酶进行标记[18]，得到酶标记抗抗体。

1.4 抗原包被浓度、单克隆抗体浓度选择及酶标板制备

(1) 对制备的抗原依次进行1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000的梯度稀释，对制备的单克隆抗体依次进行1∶10 000，1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000的梯度稀释，测定波长为450 nm，按式(1)计算百分吸光率。

(1)

式中：

K——百分吸光率，%；

B——标准品或样本溶液的平均吸光度值；

B0——0 μg/L标准溶液的平均吸光度值。

(2) 包被酶标板的抗原包被液体积为100 μL，需在37 ℃下孵育2 h，再加入150 μL 0.02 mol/L PBS缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量分数为0.05%，37 ℃下孵育2 h[19]，即完成酶标板制备。

1.5 烟叶中多菌灵残留量测定

利用RIDAWIN数据分析软件建立标准曲线，分别以待测药物的标准品浓度、Logit(B/B0)为标准曲线的横、纵坐标，将待测样本的吸光度值代入该曲线，即可测定出多菌灵残留量。

1.6 关键指标检测

1.6.1 检测限 取20份经过确证的空白样本，利用1.5的方法检测样本浓度，并计算20份样本浓度的标准差，所测样本浓度的平均值与其3倍标准差之和即为检测限[20]。

1.6.2 精密度和准确度 将多菌灵标准品添加至烟叶样本，添加浓度分别为300，600，1 200 μg/kg，检测3个浓度的烟叶样本回收率。烟叶样本做4个平行，计算相对标准偏差(RSD)。

1.6.3 稳定性 将试验制备的试剂盒于4 ℃下存放，每月固定日期测定最大吸光度值(0 μg/L)、试剂盒IC50以及烟叶样本的回收率，连续测定12个月。

1.6.4 抗体特异性 噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑与多菌灵的结构类似，测定上述药物的IC50，根据式(2)计算噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反应率。引起50%抑制的多菌灵浓度与引起50%抑制的多菌灵类似物浓度的百分比，即为交叉反应率。

(2)

式中：

R——交叉反应率，%；

C1——引起50%抑制的多菌灵浓度，μg/L；

C2——引起50%抑制的多菌灵类似物浓度，μg/L。

2 结果与分析

2.1 抗原包被浓度、单克隆抗体浓度选择

测定浓度为0.0，0.1 μg/L的多菌灵标准品的吸光度值(见表1)，根据式(1)计算B(0.1 μg/L)/B0(0.0 μg/L)的百分吸光率。理论上在抗原数量一定的情况下，抗体只有达到一定数量才能有效结合，然而实际应用中，抗原和单克隆抗体作为制备酶联免疫试剂盒的最关键原料，理想情况是在能够保证有效反应的情况下，抗体量最小；稀释倍数越大，同样产量的原料能够制备的试剂盒就越多。根据已有的研究[21]，如果能够达到B(0.1 μg/L)/B0(0.0 μg/L)的百分吸光率在70%～85%的要求，那么稀释倍数越大，原料就能节省得越多。因此，选择抗原稀释倍数为8 000，单克隆抗体稀释倍数为80 000。

2.2 标准曲线

利用RIDAWIN数据分析软件建立标准曲线(见图2)，标准曲线的范围为0.0～8.1 μg/L，试剂盒的半数抑制浓度(IC50)为0.851 μg/L；得到的线性方程为：y=-1.686x+1.117，决定系数R2为0.995。

2.3 检测限

由表2可知，该方法对烟叶、苹果、白菜及茶叶样本的检测限分别为266.3，421.0，349.1，484.4 μg/kg。优于吴燕等[12]针对茶叶建立的基于表面增强拉曼光谱测定方法(定量限为2 000 μg/L)。GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了多菌灵对苹果、白菜、茶叶的最大残留限量均为5 mg/kg(暂未对烟叶进行规定)。因此，该方法能够满足对多菌灵的检测要求。

表1 抗原、抗体的浓度选择(OD450 nm)Table 1 Optimal concentration of antigen and antibody (OD450 nm)

图2 多菌灵标准曲线Figure 2 Standard curve of carbendazim

2.4 精密度和准确度

由表3可知，不同添加水平多菌灵的烟叶样本的回收率为76.0%～102.2%，批内相对标准偏差为4.8%～9.7%，批间相对标准偏差为8.0%～8.6%。酶联免疫试剂盒的准确性与精密度有关，批内与批间的相对标准偏差均在10%以内，能保证测试的准确性。

表2 样本的检测限测定Table 2 Determination of detection limit of samples (n=20) μg/kg

2.5 稳定性

由表4可知，试剂盒于4 ℃保存能够正常检测12个月，试验期间其最大吸光度值(0 μg/L)范围为1.59～1.91，IC50范围为0.367～0.772 μg/L，烟叶样本的回收率范围为72.6%～95.3%，均未显示异常。说明该酶联免疫试剂盒的稳定性良好，在4 ℃下能够保存12个月。

表3 精密度及准确度试验Table 3 Precision and accuracy test

表4 稳定性试验Table 4 Stability of the kit at 4 ℃

2.6 抗体特异性

噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑为应用广泛的杀菌剂。通过测定多菌灵抗体与噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反应率，发现多菌灵抗体与噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反应率<1%，说明多菌灵抗体的特异性良好。

3 结论

试验建立了一种烟叶、苹果、白菜、茶叶中多菌灵残留的酶联免疫吸附方法，通过制备出特异性良好的多菌灵单克隆抗体，将其应用于酶联免疫试剂盒的制备。结果表明，该方法稳定性好，检测时间仅为45～60 min，并且不需要昂贵的仪器，适用于基层实验室对烟叶、苹果、白菜、茶叶中多菌灵残留量进行批量检测。GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了多菌灵对6种谷物、4种油料油脂、16种蔬菜、28种水果等食品类别的最大残留限量，而试验研究样本仅限于苹果、白菜等果蔬，今后可根据市场需求，结合该标准对样本进行拓展。