肝细胞癌中bcl-2家族对化疗耐药的研究进展

吴 军，郑庆范，盛基尧，姚小晓*

(1.吉林大学第二医院 肝胆胰外科，吉林 长春 130041；2.吉林大学中日联谊医院 胃肠内科，吉林 长春130033)

在全球范围内，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是癌症相关死亡第二大肿瘤，占90%[1]。其特点为病死率、致死率高，侵袭性强，对化疗药物敏感性低，易产生耐药性[2]。晚期HCC化疗方案主要得益于阿霉素(adriamycin，DOX)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)和铂类等药物。但是由于肝细胞癌的多药耐药性(Multi-drug Resistant，MDR)，一些HCC患者对化疗的反应较差，对特定药物以及其他具有不同结构和机制的药物也具有抗性，常易导致转移、复发、预后不良[3-4]。研究表明，HCC患者的Bcl-2水平呈高表达，同时Bcl-2家族参与HCC化疗耐药机制[5-6]。现阶段，在临床HCC治疗中化疗耐药仍然是一个艰巨的问题，进一步研究Bcl-2家族在HCC化疗耐药的分子机制，有利于开发针对HCC新的治疗靶点及相关诊断生物标志物，为解决化疗耐药问题提供坚实的理论依据。

1 Bcl-2蛋白家族在HCC化疗耐药机制的研究

B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2) 家族蛋白由抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白组成，常位于造血细胞中的内质网、细胞核及线粒体附近，现已发现的Bcl-2家族成员有25种[7]。Bcl-2家族蛋白分为3个亚组，其中抗凋亡Bcl-2家族蛋白包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、BFL1/hA1、Bcl-w、Bcl-B蛋白[5,8]。促凋亡Bcl-2家族蛋白因其均含有BH1-3结构域，又称为“多结构域蛋白”，其中包括Bax、Bok及Bak。其余只具有BH3结构域的促凋亡蛋白被称为“BH3-only”蛋白，如Bid、Bad、Bim、Noxa、Bik及Puma蛋白[9]。Bcl-2蛋白通过抑制线粒体中细胞色素C的释放并通过氧化阻止细胞的破坏来阻止细胞凋亡过程，其过表达及磷酸化参与细胞增殖的调控，在肿瘤的形成和多药耐药中存在极为重要的作用，是一个有效的肿瘤治疗靶点[10]。HM[6]等人利用45例HCC患者的血清与肿瘤组织评估Bcl-2蛋白的表达，研究表明HCC患者血清相比健康人血清Bcl-2水平显著升高(50.28±25.83u/ml vs 26.65±8.63u/ml，P<0.05)，Bcl-2免疫组织化学定位在HCC中达35.9%，其阳性率与组织学等级成反比(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级分别为47.4%，25%，25%)，Bcl-2家族在HCC发生中发挥抗凋亡的作用。已有研究证明，甘氨鹅脱氧胆酸钠(glycochenodeoxycholate，GCDA)通过增强Bcl-2家族中在T163磷酸化，促进HCC细胞的具有耐药性[11]。此外，Zhou等[12]人证实了GCDA诱导的肝癌细胞的存活和化学抗性可能通过MAPK/ERK1/2途径在Ser70位点被磷酸化激活Bcl-2而发生，为Bcl-2家族在HCC化疗耐药机制的研究提供了理论支持。Wu等[13]人在研究肝癌中淀粉样蛋白前体蛋白(APP)与5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药性的关系中发现，APP的过表达和沉默可以调节Bcl-2和Bcl-xl的表达，初步揭示了APP的过表达通过Bcl-2途径促进HCC对5-FU的耐药性。Chen[14]等人研究发现染色体缩合调控子2(RCC2)介导的生存蛋白表达的下调是通过AKT和Bcl-2途径发生的，促进HCC的转移以及产生对顺铂耐药性。另外You等[15]人研究发现，BCL-2 的AKT依赖性表达介导了TFF3刺激HCC细胞的致瘤性和化疗耐药性，抑制TFF3表达可能能够阻碍HCC的发生进展，并克服HCC的化疗耐药性。Fang等[16]人在探讨 UBC9 介导的肝细胞癌细胞对DOX化疗敏感性的机制中发现，下调UBC9 表达减少了Bcl-2和Bcl-xl的表达，与DOX诱导的细胞凋亡减少有关。敲除UBC9可能具有肿瘤抑制作用，UBC9亦可能是治疗HCC癌症的潜在靶点。

2 非编码RNA在Bcl-2家族HCC化疗耐药的作用

2.1 miRNA在Bcl-2家族HCC化疗耐药中的作用

MicroRNA(miRNA)可以靶向mRNA，通过翻译抑制或诱导mRNA降解参与转录后调控。HCC的化疗耐药性与miRNA在很大程度上密切相关，有许多研究报道miRNA通过多种途径参与到了HCC化疗的多药耐药及单一耐药的过程(表1)。但其中不可或缺的信号途径是Bcl-2途径。Song等[17]人发现miR-29a通过结合其mRNA 3’UTR下调HCC中的Bcl-2，验证了在HCC组织中miR-29a和 Bcl-2信号途径之间的相关性，揭示了miR-29a 可以作为预防和干预 HCC的关键靶点以及miR-29a通过Bcl-2信号途径调控HCC化疗耐药。Xie[18]等人发现了miR-455的表达能够下调Bcl-2家族蛋白水平，进而促进HCC细胞凋亡并且抑制其增殖。Liao等[19]人探究了miR-488在HCC中的作用发现，miR-488在HCC中的水平低于临近正常组织，其下游靶标为Bcl-2，呈高表达，miRNA-448可通过靶向肝癌中的Bcl-2而发挥抑癌作用。Ming等[20]人同样对于miR-125a-5p在HCC的发生发展机制进行研究，研究表明，miR-125a-5p在HCC细胞株中被下调，通过靶向Bcl-2抑制HCC细胞株的增殖与侵袭并诱导细胞凋亡，miR-125a-5p可能是治疗HCC的一种新颖而有希望的治疗靶标[20]。Fu等[21]人同样发现miR-155-5p通过激活Bcl-2抑制HCC凋亡。同样Zhao等[22]人也在miR-330-3p中得到相似结论。Jiang等[23]人探究了miR-26b与Mcl-1在TRAIL诱导HCC细胞凋亡中的作用，研究发现，miR-26b是Mcl-1的负调控因子，同时能够敏化TRAIL诱导HCC细胞凋亡，提示miR-26b/Mcl-1途径可能是治疗HCC的新靶点。He等[24]人在研究中发现，在HCC细胞中miR-101是Mcl-1的负调控因子，miR-101通过靶向Mcl-1使HCC细胞对阿霉素诱导的细胞凋亡敏感性增加。Ge等[25]人探究了miR-377与Bcl-xl在HCC细胞凋亡中的作用，研究发现，miR-377在HCC细胞中明显表达下调。miR-377表达的降低通过靶向其3′-非翻译区(3′-UTR)促进Bcl-xL表达的上调。在功能上，敲低miR-377明显增加了HCC细胞的生长和集落形成，并抑制了细胞凋亡。这项研究为将miR-377用作HCC治疗中的潜在分子靶点提供了新见解。

miRNA通过作为肿瘤抑制或促进因子通过靶向Bcl-2家族蛋白在HCC的发生发展、增殖凋亡过程中作用显著，为研究HCC化疗耐药机制在miRNA水平找到了新的研究方向。

2.2 LncRNA在Bcl-2家族HCC化疗耐药中的作用

长链非编码 RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)是抑制肿瘤发生发展的关键RNA，通过调节细胞凋亡、药物外排、药物代谢，DNA修复、调节EMT等作用成为潜在介导药物耐药性的重要RNA。

表1 非编码RNA在Bcl-2家族HCC化疗耐药的作用

越来越多的研究表明，lncRNA在HCC的发生发展和耐药的调控中起着至关重要的作用，作为新型HCC治疗靶点存在意义[26-31]。Xiao等[32]人探究了HCC相关的lncRNA(HANR)在HCC的发生发展和阿霉素(DOX)耐药中的作用和机制，结果表明，上调HCC组织中的HANR可以拮抗HCC对DOX的敏感性，此外，Li等[33]人揭示了长非编码RNA (lncARSR) 在 HCC 细胞化疗耐药中的关键作用， lncARSR 的过表达增强了HCC对于多柔比星的耐药性，而在体外和体内敲除 lncARSR 增加HCC对DOX的敏感性。上调 lncARSR 通过调节 PTEN-PI3K/Akt 通路促进HCC对DOX的耐药性，提示lncARSR可能作为HCC化疗耐药性的一个有前景的预后生物标志物和治疗靶点。

LncRNA同时也通过不同途径对Bcl-2家族产生不同程度的调控(表2)，进而调节HCC化疗耐药。Zhang等[34]人对于LncRNA HOTAIRM1在HCC发病机制中存在的作用及其潜在的机制对于30例HCC组织及癌旁组织进行研究，结果发现，在HCC组织中观察到的lncRNA HOTAIRM1表达低于癌旁组织，过表达的lncRNA HOTAIRM1显着增加了凋亡促进因子Bax的表达，同时降低了Bcl-2的表达。LncRNA HOTAIRM1在HCC的下调，可能是通过上调Bcl-2的表达，同时抑制Wnt通路来抑制HCC的增殖能力并促进其凋亡，从而抑制HCC的进展。Zhang等[35]人探索了LncRNA MEG3在HCC发展侵袭的分子机制，研究发现，LncRNA MEG3在HCC中的过表达抑制了HCC细胞的增殖及转移，并抑制了Bcl-2家族的表达，在HCC中发挥抑癌基因的作用，LncRNA MEG3的缺失或表达下调可能会促进HCC的发展。Wu等人[36]在最新的研究中发现，在HCC细胞中，lncRNA Golgin A2假基因10(GOLGA2P10)可提高Bcl-xL蛋白水平，促进BAD(Bcl-2-associated death protein)磷酸化，并使HCC细胞对内质网应激诱导的细胞凋亡具有抗性。同时，BCL-xL的过表达或BAD的敲除抑制了GOLGA2P10的促凋亡作用，GOLGA2P10的上调通过调节Bcl-2家族成员Bcl-xl、BAD，保护HCC细胞免受肿瘤微环境中持续的内质网应激出现的细胞毒性作用，这项研究突出了GOLGA2P10作为潜在的治疗靶点有一定的意义。现有研究证实了，在HCC中LncRNA RP5-833A20.1[37]、LncRNA HEIH[38]、LncRNA Tim3[39]等过表达也会降低Bcl-2的表达。

lncRNA通过多种分子机制及调节途径，作用于HCC对化疗耐药的机制中，这为HCC的治疗方案提供全新的思路。

表2 LncRNA在Bcl-2家族HCC化疗耐药的作用

2.3 circRNA在肝细胞癌化疗耐药的作用

新兴的研究发现，环状RNA(circRNA)在HCC中差异表达，并在HCC的发生发展和转移过程中起重要作用。circRNA是一类没有聚(A)尾的共价闭合连续环特定的非编码RNA[40,41]。它们的特征是。最近，发现了数千种内源性circRNA。通过海绵化microRNA或与其他分子相互作用来介导基因表达，然后抑制其功能[42]。在长期化疗期间，HCC中经常发生多药耐药性，导致复发，越来越多的研究阐述了ncRNA(miRNA、lncRNA)在HCC化疗耐药中的关键作用。Luo等[43]人研究了circRNA在HCC顺铂耐药中的作用，结果显示，过表达 circRNA_101505在体内和体外抑制HCC增殖，并增强肝癌细胞中顺铂的毒性，circRNA_101505可以通过海绵化miR-103使HCC细胞对顺铂敏感性增加，结果表明，circRNA_101505 是HCC治疗的潜在治疗靶点。Zhou等[44]人同样对于circRNA_101237在HCC顺铂耐药中进行研究，结果显示，耐顺铂的HCC患者的血清中的circRNA_101237水平升高。circRNA_101237在HCC患者的组织和血清中表达上调，可作为诊断和预后的生物标志物。证明circRNA_101237可以用作HCC的诊断生物标志物和克服顺铂耐药性的潜在治疗靶标。同样，Chen等[44]人探究了circRNA_0003418在HCC发生发展中的机制，研究表明敲低可促进HCC细胞的增殖，迁移和侵袭，在体内和体外抑制circRNA_0003418增强了HCC细胞的顺铂耐药性，敲除circRNA_0003418激活了HCC细胞中的Wnt /β-catenin信号传导途径。抑制Wnt /β-catenin途径后，circRNA-0003418对HCC细胞对顺铂敏感性的影响被逆转。

circRNA对于Bcl-2亦存在相应的调控机制，从而进一步调控HCC化疗耐药。Yang等[45]人在探究circ-BIRC6在HCC进展中的作用机制中发现了circRNA BIRC6在HCC中表达上调，抑制circ-BIRC6的表达可减少HCC细胞的增殖，迁移和侵袭，并促进其凋亡。circ-BIRC6发挥竞争性内源性RNA的功能，通过海绵化miR-3918来调节Bcl-2蛋白的表达，作为HCC治疗的预后生物标志物和治疗靶标有一定的潜力。Yang等[46]人在探究circZFR在HCC进展中的功能及其潜在的分子机制中发现，在HCC中circZFR上调其靶基因AKT1，从而激活与增殖相关的蛋白(c-Myc，cyclin D1，Survivin和Bcl-2)的级联反应，从而参与到HCC细胞凋亡与增殖的过程中。此外，在HCC中circRNA与Bcl-2家族蛋白的研究进展尚不全面，有待进一步探索其中的关系，以进一步探究circRNA在HCC细胞增殖及凋亡中的作用与意义。

现阶段，circRNA对于调控HCC化疗耐药的机制尚未明确，有待在未来进一步阐明，从而为circRNA 在HCC中的治疗用途提供重要证据。

3 肝细胞癌肿瘤微环境中化疗耐药机制

HCC的肿瘤微环境，即HCC细胞生长的细胞环境，包括肝星状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、细胞因子、趋化因子及细胞外基质。在HCC演变中起关键作用。肿瘤微环境中细胞之间的自分泌和旁分泌信号通路会导致细胞外基质硬度增加，血液和淋巴管形成，诱导肿瘤进展[47]。由于肿瘤存在多药耐药性(MDR)，常会导致肿瘤复发。现今研究越来越多地显示出肿瘤微环境在肿瘤进展和MDR中起着关键作用[48]。肿瘤可以在其微环境中迅速增殖并从宿主防御系统逃脱，以抵抗受损细胞。肿瘤微环境成分还使肿瘤细胞有机会降解，准备通过基底膜并侵入。这些特征使肿瘤微环境成为肿瘤发展及凋亡过程中的相关成分。

肿瘤组织继发于异常血管的渗透性过高，氧气含量低，pH值低导致继发性灌注不足，促进其化学耐药性[49-50]。与正常细胞相比，在低氧条件下肿瘤细胞出现Warburg效应，即表现出更高的葡萄糖代谢率，优先利用糖酵解而不是氧化磷酸化，最终产生乳酸，导致细胞内酸化[49-50]。转录因子缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在细胞对缺氧的应答以及疾病过程(如致癌性)中起着重要作用[51]。低氧诱导的细胞凋亡发生在大多数正常细胞类型和组织中，但在肿瘤细胞中低氧条件下能够表达HIF-1α并可以存活[52]。急性缺氧可能导致细胞调亡，但长时间缺氧会诱导细胞产生对于细胞凋亡的抗性以及对于放疗、化疗的抗性，但其机制尚不清楚[53]。Xu等[54]人研究了HIF-1α对于HCC细胞凋亡的影响，研究发现，HIF-1α可以抑制HCC细胞的凋亡，常氧条件下HCC细胞中Omi/HtrA2 mRNA和蛋白表达随HIF-1α表达增加而降低，而Bcl-2 mRNA和蛋白表达随HIF-1α表达增加而升高。HIF-1α通过抑制Omi/HtrA2表达同时上调Bcl-2的表达，抑制Omi/HtrA2从线粒体释放进而抑制HCC细胞的凋亡。Liu等[55]人进行了在缺氧的条件下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)/骨膜素轴对于肝细胞癌(HCC)细胞的三氧化二砷抗性的促进作用的研究中发现，低氧下的HCC细胞比常氧下具有更高的三氧化二砷抗性，骨膜素的过表达增强了HIF-1α转录活性，并诱导了HCC细胞中血管内皮生长因子、Mcl-1和Bcl-xL的表达。骨膜素在低氧的肿瘤微环境下促进了HCC对于三氧化二砷的抗性，可能与促进HIF-1α依赖性存活基因的激活有关。靶向骨膜素可能会改善具有三氧化二砷抗性的HCC治疗的有效策略。Yu等[56]人对于低氧条件下HCC中对于三氧化二砷(As2O3)联合5-FU或顺铂的化学耐药性的作用研究中发现，在低氧条件下，As2O3联合5-FU可导致HCC中DR5，caspase 3，caspase 8和caspase 9的表达上调，以及Bcl-2表达下调，但对DR4的表达没有影响。Meyenberg等[57]人评估了MSAGM：VO复合物(来自亚马逊裂殖酵母的半乳甘露聚糖(MSAGM)与氧钒(IV/V)的复合物)在低氧条件下对于HCC的抗肿瘤作用的研究中发现，低氧条件下，HCC细胞中MSAGM：VO复合物的强凋亡活性已完全丧失，Bcl-2蛋白家族的促凋亡和抗凋亡成员之间存在动态平衡。缺氧时抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-XL的表达增加，而促凋亡蛋白Bax的表达降低。在肿瘤微环境缺氧的条件下，Bcl-2蛋白家族被不同程度的调节，同时HIF-1α也经过不同信号途径参与到HCC细胞凋亡的过程中。