MicroRNA-21-5p 和MicroRNA-18b-5p在大肠癌中的表达及意义

刘日旭，王 乙，曹 岩，刘明开

(大连大学附属新华医院 检验科，辽宁 大连116021)

MicroRNA(miRNA)是一种参与转录后的基因表达水平调控的内源性非编码小RNA分子,研究发现，存在于癌症相关基因组区域的脆性位点中的miRNA被异常激活后可转变为原癌基因，诱导细胞癌变的发生[1]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)基因家族，包括PIK3CA、AKT和PTEN，是人类各种癌症中最常见的突变基因之一。PI3K途径突变可以直接增强PIK3CA和AKT的信号传导，也可以通过使PTEN调节因子失活的负性调控来增强信号传导。目前肿瘤治疗的新策略正在围绕PI3K-AKT信号通路中重要分子及其靶基因进行研究[2]。本研究采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对MicroRNA-21-5p(miR-21-5p)和MicroRNA-18b-5p(miR-18-5p)在大肠组织中的表达水平进行检测，并应用免疫组织化学方法对PI3K在大肠组织中的表达水平进行检测，探讨mir-21-5p和mir-18-5p在大肠癌发生发展中的作用，研究mir-21-5p和mir-18-5p对PI3K/AKT信号通路及其靶基因的调控作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料

50例病例均为2018年1-9月经临床及组织病理学检查确诊为原发性大肠癌的住院患者。其中男性27例，女性23例，平均年龄61.9岁。

1.2 标本来源

病变组(CRC)为大肠癌组织，对照组(NCM)为距肿瘤边缘超过8 cm的癌旁正常黏膜组织。收集术中新鲜组织标本，用于qPCR检测的置于液氮保存；用于免疫组化检测的经过10%甲醛固定后石蜡包埋保存。

1.3 方法

1.3.1qPCR方法对大肠组织标本进行miR-21-5p和miR-18-5p相对表达量的分析 RNA提取试剂RNAiso Plus Reagent、U6引物、miR-21-5p引物、miR-18-5p引物、RT试剂盒和qPCR试剂盒，来源于大连TaKaRa公司。计算并评价RNA纯度使用 Thermo NanoDrop 1000超微量分光光度计测定RNA在260 nm、280 nm的吸收值。检测RNA纯度及完整性使用变性琼脂糖凝胶电泳。RT反应使用TaKaRa TP600型梯度PCR仪。qPCR反应使用TaKaRa TP800型实时荧光定量PCR仪。

按照RNAiso Plus Reagent试剂盒说明书，进行大肠癌组织及癌旁组织Total RNA的提取。将Total RNA 10ng作为模板，进行逆转录cDNA的合成。用无菌超纯水稀释cDNA 10倍后，以U6引物为内参，进行qPCR反应，检测miR-21-5p和miR-18-5p的相对含量。RT反应条件:37℃，60 min；85℃，5 min。qPCR反应条件:95℃，预变性10 min；95℃，变性10 s；60℃，退火20 s；72℃，延伸30 s，共40个循环,计算病变组和对照组的miR-21-5p和miR-18-5p的相对表达水平采用2-△CT法(△CT=CT目的基因-CTU6)。

1.3.2免疫组化法检测组织标本中PI3K 的表达 小鼠抗人PI3K单克隆抗体来源于SANTA CRUZ公司；免疫组化试剂盒来源于福州迈新生物。标本组织以4-5 μm厚度连续切片，脱蜡水化后按试剂盒说明书进行染色，以已知的大肠癌阳性组织切片为阳性对照，PBS液代替一抗为阴性对照。

标准及判读：参照文献方法观察PI3K的分布和阳性率。细胞胞质呈棕黄色为PI3K的阳性表达。计数高倍镜下4个不同视野200个细胞，以阳性细胞的百分比为最终结果。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行数据整理和统计。检测数据用均值±标准差表示。两组间比较采用t检验，P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR实验的结果电泳结果显示如图1，OD检测结果显示，A260 nm/A280 nm的比值为1.98，在1.8-2.1范围内，符合qPCR检测的要求。

图1 RNA琼脂糖电泳结果

2.2 miR-21-5p和miR-18-5p在大肠癌组织和癌旁正常黏膜组织中的表达qPCR统计结果表明，在50例配对组织标本中，miR-21-5p和miR-18-5p在大肠癌组织中表达水平显著高于在癌旁正常黏膜组织中的表达水平，具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 miR-21-5p和miR-18-5p在大肠癌组织和癌旁正常黏膜组织的表达水平

2.3 免疫组化实验的结果

免疫组化检测结果表明，在50例大肠癌组织中，PI3K阳性细胞呈弥漫性分布，并多数聚集成团(图2)，其阳性表达率为80.3%±1.47%。在50例癌旁正常黏膜组织中，PI3K阳性细胞呈局限性分布于大肠黏膜腺体间质中，呈现散在阳性(图3)，其阳性表达率为11.11%±0.69%。PI3K阳性细胞的分布范围和反应强度在大肠癌组织中均明显高于癌旁正常黏膜组织(P<0.05)。

2.4 大肠癌组织中miR-21-5p和miR-18-5p与PI3K表达的相关性

统计学分析表明，大肠癌组织中的miR-21-5p与PI3K表达水平明显正相关(r=0.810,P<0.05)；miR-18-5p与PI3K表达水平明显正相关(r=0.790，P<0.05)。

图2 PI3K在大肠癌组织的表达(SP×400)

图3 PI3K在癌旁正常黏膜组织的表达(SP×400)

3 讨论

近年来，随着精准医学概念的兴起，分子生物学检测成为肿瘤诊断和治疗的重要环节。研究发现，多种miRNA在大肠癌患者组织、血浆和粪便中的表达明显失衡[3-5]，通过检测异常表达的miRNA，不仅有助于肿瘤的早期筛查，更有助于疾病分型、监测、预后评估及指导用药[6]。miR-21-5p在肠癌组织中表达水平明显升高，并可以通过持续活化PI3K通路，调节肿瘤细胞的增殖、侵袭[7]。TOIYAMA等人发现miR-21-5p在大肠癌患者血浆中表达水平显著升高，在诊断及术后监测方面优于癌胚抗原(CEA)[8]。miR-18-5p与癌细胞凋亡有紧密的联系，但是miR-18-5p对大肠癌的相关调控作用研究较少。Katayama等人研究显示，肝癌中miR-18-5p表达水平增高。Murakami等人研究显示，肝细胞癌分化程度与miR-18-5p表达水平负相关[9]。ZENG等研究显示，肺癌中miR-18-5p表达水平增高[10]。由于miR-18-5p非某器官组织的特异性基因，在大肠癌中表达也有增加，可能在大肠癌的发病中起到广泛的作用。存在于正常组织中的PI3K/AKT信号转导通路，具有正常的信号转导功能。生物信息学的分析显示，miR-21-5p和miR-18-5p的靶基因为PTEN[11，12]。PTEN调节因子的负性调控使PI3K/AKT途径的信号传导增强导致突变。

本研究发现,miR-21-5p和miR-18-5p在大肠癌组织中的表达水平均超出癌旁正常黏膜组织数倍,同时PI3K蛋白在大肠癌组织中呈现弥漫性高表达，在大肠癌旁正常黏膜呈现局部性低表达，二者具有正相关性。结合生物信息学可以推测，大肠组织中的miR-21-5p和miR-18-5p因致癌因素的刺激而过表达，使PTEN的抑癌功能受限，PI3K/AKT信号通路持续活化，推进大肠癌的发生和发展。