弹力纤维染色与双重免疫组化染色在肺腺癌胸膜侵犯判断的应用及体会

丁闻洁，赵继开，吴佳君，韩昱晨

肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。患者的5年生存率低于20%，主要死亡原因是复发和转移。根据NCCN指南TNM分期标准，即使肿瘤直径≤3 cm，只要侵犯脏层胸膜，应归为T2期，而非T1期。因此对肺癌患者进行准确临床分期具有重要意义，正确判断肿瘤是否侵犯脏层胸膜尤为重要[1-2]。本科室在实际工作过程中采用维多利亚蓝弹力纤维染色结合免疫组化双重染色，能清楚地显示肺癌组织弹力纤维与肿瘤细胞间的关系，以准确判断是否存在胸膜侵犯。

1 材料与方法

1.1 材料选取上海市胸科医院2018年手术切除的肺腺癌标本42例，所有患者术前均未接受放、化疗。标本经10%中性福尔马林固定、常规脱水、石蜡包埋，3 μm厚切片。

1.2 试剂(1)维多利亚蓝染液的配制：维多利亚蓝2 g，糊精0.5 g，间苯二酚4 g，蒸馏水200 mL；将蒸馏水倒入500 mL烧杯中，加入维多利亚蓝、糊精和间苯二酚溶解，慢火中煮沸；再用另一只烧杯煮沸30%三氯化铁液25 mL，慢慢倒入维多利亚蓝混合液中，继续煮沸3 min，不断搅拌呈胶体物。冷却后过滤，将沉渣和滤纸放在60 ℃烧箱内烤干。取另一只烧杯盛70%乙醇400 mL溶解沉渣，再加入冰醋酸4 mL和苯酚6 g作为防腐剂，放置1周成熟后使用。(2)免疫组化试剂：一抗TTF-1购自上海泉辉公司，calretinin购自北京中杉金桥公司，二抗系统、DAB显色液购自罗氏诊断产品(上海)公司。(3)免疫组化仪器：Benchmark XT全自动免疫组化机，罗氏诊断产品(上海)公司。

1.3 方法在同一张切片上行免疫组化双重染色及弹力纤维染色。首次染色采用免疫组化法：(1)将切片置于60 ℃电热培养箱中烤2 h后，放入Benchmark XT全自动免疫组化机中，EZ prep脱蜡1次，每次10 min；(2)脱蜡后的切片依次置于Reaction Buffer各2 min逐级水化，蒸馏水漂洗2次，每次1 min；(3)0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液加热法进行抗原修复15 min，自然冷却后PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5 min；(4)每张切片滴加1滴(50 μL)3%过氧化氢阻断液，室温孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗5 min×3次；(5)每张切片滴加100 μL一抗TTF-1，室温孵育60 min；(6)PBS冲洗5 min×3次，每张切片滴加1滴(100 μL)二抗，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次；(7)每张切片滴加DAB 100 μL，冲洗终止显色；(8)一抗calretinin室温孵育60 min；(9)PBS冲洗5 min×3次，二抗37 ℃孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次；(10)每张切片滴加Fast Red溶液100 μL，冲洗终止显色；每批染色均用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。第二重染色按维多利亚蓝法显色弹力纤维：(1)免疫组化显色终止水洗后加入1%高碘酸氧化10 min；(2)水洗；(3)70%乙醇稍洗；(4)置入维多利亚蓝液内染120 min；(5)95%乙醇分色数秒；(6)流水稍冲洗；(7)苏木精10 min；(8)水洗；(9)0.5%盐酸乙醇1～2 s返蓝；(10)干燥、透明、中性树胶封固。

2 结果

第一重染色，肺腺癌细胞核表达TTF-1，DAB显色呈棕色；胸膜表面间皮细胞中calretinin呈核质着色，Fast Red显色呈红色。第二重染色，弹力纤维为蓝绿色，粗细不等，呈波浪状(图1)。42例肺腺癌标本分别采用传统胸膜弹力纤维染色和免疫双染进行分组后观察T分期变化(表1)，1例T2期肿瘤(3 cm<肿瘤最大径<5 cm)虽然分期不变，胸膜情况则由原来的侵破脏层胸膜间皮层降为侵犯脏层胸膜弹力层但未突破间皮层(图1)。2例T1期肿瘤提升为T2期，免疫组化双重染色加弹力纤维染色能够清楚地显示单个或散在侵犯脏层胸膜弹力层的肿瘤细胞(图2)。

表1 42例肺腺癌T分期变化[n(%)]

①A①B①C②A②B②C

3 讨论

弹力纤维在人体分布广泛，皮肤、耳廓、血管壁、韧带、腺管壁、气管、支气管、肺泡等部位较丰富，由弹性蛋白组成，纤维细小，交织成网。常规HE染色难以区分胶原纤维和网状纤维。弹性纤维染色在肺中主要用于判断胸膜浸润存在的问题，有无突破弹力层直接影响着患者的临床分期，目前弹力纤维染色与免疫组化双重染色在心血管系统疾病中已有研究报道[3-5]，但在肺中免疫组化双重染色及弹力纤维染色法并无相关报道，本组中弹力纤维染色采用的是维多利亚蓝染色法，较碱性品红等染色方法有明显优点：染色时间短，仅用1～2 h；染液能保存数年，且能反复使用；HE、VG复染效果清晰等。维多利亚蓝染色的主要原理是利用间苯二酚与三氯化铁组成带有弱正电荷的染料非极性吸着弹性纤维完成染色。

由于脏层胸膜弹力层和癌组织间有大量的纤维组织及血管增生，脏层胸膜覆盖在肺表面并深入肺叶间隙，HE染色时难以观察胸膜是否被真正侵犯，且在日常工作中，一些肿瘤组织靠近胸膜的蜡块又同时需要行免疫组化和弹力纤维染色时，反复的修整蜡块，容易造成贴近胸膜少量癌巢被修掉而造成胸膜判断的不准确性，所以在一张切片行弹力纤维与免疫组化双重染色可以清晰地显示一些癌组织浸润情况及与弹力纤维的关系，脏层胸膜间皮细胞下面的第一层弹力纤维经染色后呈蓝色，如果癌细胞破坏蓝色弯曲的弹力纤维的连续性，则证明存在胸膜侵犯。

本组非小细胞肺癌病例在经过弹力纤维染色加HE与弹力纤维染色加免疫组化对比后，T1、T2分期中2例T2期低分化癌未被检出，被错误划分为T1期，T3、T4期无显著差别，根据国际肺癌研究会(IASLC)第7版提示肺脏层胸膜侵犯为肿瘤T1和T2期关键指标，所以在分化较差的肿瘤中弹力纤维加免疫组化双重染色能更准确的显示肿瘤和胸膜的浸润情况，采用免疫组化双重染色技术，更有利于对肿瘤组织学结构判读，从而更易作出正确判断，减少误差。本实验采用肺常规检查免疫组化TTF-1和calretinin，再与弹力纤维染色相互联用，使之更直观的看清肿瘤组织对胸膜的侵犯程度。这样对一些微小的病变区域的诊断提供更客观和直观的依据，如果分开免疫组化、弹力纤维染色等各自单染，反复的修切蜡块也易造成胸膜分期的不确定性，所以现实工作中取材时靠近胸膜的位置取2块组织，并在常规HE切片中与弹力纤维染色加免疫组化双重染色一同制片，提供最可靠的胸膜侵犯诊断依据，为临床提供更可靠的数据。

在染色过程中主要需注意：(1)维多利亚蓝染液浸染后，用乙醇分色要注意其分化时间，动作应迅速；(2)苏木精染色后用盐酸乙醇动作也应迅速，避免弹力纤维褪色，也可以选择Mayer苏木精，这样可以减少盐酸乙醇对苏木精的褪色，本组实验因不使用伊红所以也减少复染对弹力纤维染色的覆盖与褪色，能更清晰的显示弹力层，操作简便，便于操作。

总之，随着病理学技术的发展，特殊染色与免疫组化双重染色越来越多地运用于病理工作中，为病理诊断及科研提供了帮助。