免疫组化双重染色技术在胸腺肿瘤PD-L1检测中的应用

邢 杰，赵继开，丁闻洁，韩昱晨

PD-1/PD-L1通路已经在多种肿瘤中进行了广泛深入的研究，如黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌等，并且PD-1/PD-L1表达可能与恶性肿瘤的临床病理特征或不良预后相关[1-3]。近年来国内外关于胸腺瘤PD-1/PD-L1的研究较少，但均表明PD-L1表达与胸腺肿瘤(包括胸腺瘤和胸腺癌)的组织学类型、Masaoka分期以及疗效相关，并且能够提示肿瘤的恶性程度及预后[4-7]。常规PD-L1检测方法为免疫组化，但PD-L1在正常的胸腺上皮细胞及淋巴细胞中也有表达[8-9]，可能使得免疫组化染色结果判读困难，为解决这一问题，作者尝试采用p63+PD-L1免疫组化双重染色法对胸腺肿瘤进行染色，由于p63广泛表达于上皮源性肿瘤细胞胞核，p63+PD-L1免疫组化双重染色法能够更加清楚的判断胸腺源性上皮细胞的PD-L1阳性率。

1 材料与方法

1.1 材料收集上海市胸科医院病理科存档的胸腺肿瘤手术切除样本60例，其中B1、B2及B3型胸腺瘤各15例，胸腺癌15例，每例胸腺肿瘤连续切片3张，分别用于HE染色、PD-L1免疫组化染色、p63+PD-L1免疫组化双重染色。

1.2 染色方法标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，免疫组化染色采用Multimer法，染色平台为Dako Link 48全自动免疫组化染色平台，一抗PD-L1(22C3，1 ∶50，Dako公司)、p63(1 ∶300，上海长岛生物公司)，其他试剂均为Dako Autostainer Link48全自动免疫组化染色平台专用试剂，购自安捷伦科技(上海)公司。

1.3 结果判断将染色后的切片交由科内经过PD-L1判读专业训练的3名医师阅片，并根据判读的难易程度进行评分，评分内容包括染色效果、特异性着色部位及非特异性着色部位判断，然后进行综合评分，易于判读为Ⅰ级，判读难度一般为Ⅱ级，难以判读为Ⅲ级，3名医师分别就相应的切片进行分级，每个级别取3名医师打分的平均值。将判读结果进行统计学分析，使用SPSS 19.0软件进行分析，分析方法为χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PD-L1在胸腺肿瘤细胞中的表达评分结果显示(表1，图1～4)，B1型、B2型、B3型胸腺瘤PD-L1免疫组化染色与PD-L1+p63免疫组化双重染色相比，在判读难易程度上差异有显著性(P值分别为<0.001、0.001、0.033)；胸腺癌PD-L1免疫组化染色与PD-L1+p63免疫组化双重染色评分结果相比，差异无统计学意义(P=0.583)。

表1 两种免疫组化染色结果判读难易程度对比

①A①B①C②A②B②C③A③B③C④A④B④C

3 讨论

胸腺属于人体中枢免疫器官，是T细胞分化、发育和成熟的场所，胸腺瘤主要起源于胸腺上皮及淋巴细胞，PD-L1不仅在胸腺上皮源性肿瘤细胞中表达，在正常胸腺上皮细胞以及淋巴细胞中也有部分表达，这就给PD-L1在肿瘤性上皮细胞中表达的免疫组化染色的结果判读带来了很大挑战。p63是p53抑癌基因家族的成员，在胚胎外胚层的发育和上皮组织的发育、分化以及维持细胞形态等方面发挥着重要作用，p63蛋白广泛表达于上皮组织细胞核。将p63和PD-L1两种抗体结合起来，使用免疫组化双重染色法，使得胸腺上皮来源的肿瘤细胞胞核呈p63免疫组化染色的红色，细胞膜呈现PD-L1免疫组化染色的棕色，而部分淋巴细胞仅在细胞膜上有PD-L1表达，细胞核无p63表达。借助p63+PD-L1双重免疫组化染色，我们不仅能够判断PD-L1在胸腺肿瘤性上皮中的表达，也能够在一定程度上反映出在胸腺中各种淋巴细胞PD-L1的表达状态，为今后进一步分析胸腺组织中各种细胞成分PD-L1表达状况，与胸腺肿瘤临床病理特点及免疫治疗的相关性，提供更多的数据支持。

综上，PD-L1+p63免疫组化双重染色能够很好的帮助病理医师在判读PD-L1阳性率的过程中，准确地识别非特异性着色。