前列腺癌组织中Nanog、SOX2的表达及其临床意义

李 梅，何桂芳，李明凤，郑露露，蔡永萍,，尹 玉,

目前，前列腺癌(prostate cancer, PCa)的发病率和病死率均较高，已成为男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤[1]。由于我国人民生活方式日趋西化及医疗水平的提高，PCa的检出率逐年增加。因此，识别新的诊断和治疗方案研究PCa的发病机制意义重大。Nanog基因是肿瘤干细胞的转录因子，在维持干细胞的多能分化性、调节细胞增殖及非对称分裂起关键作用[2]。Nanog在多种实体肿瘤的癌变和进展中起主导作用，包括乳腺癌、胚胎性癌症、精原细胞瘤和原位睾丸癌等；且Nanog表达增加与癌症的临床进程有关[3]。在PCa干细胞研究中，Gong等[4]认为Nanog作为维持干细胞多能性的关键分子，是分离和鉴定PCa干细胞的标志物；Jeter等[5]也提出Nanog可以促进PCa的干细胞特性，可促进去势抵抗性PCa细胞的再生。SOX2是SOX基因家族的重要成员，最近的研究表明，SOX2与转移性PCa的发生、发展和预后不良有关。同时SOX2与Nanog协同对维持胚胎干细胞多能性以及特定组织成体干细胞自我更新的能力具有关键作用。本文收集PCa组织和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)组织，检测Nanog和SOX2的表达，探讨两者的相关性及其与PCa发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年1月～2016年12月安徽医科大学第一附属医院行活检或手术切除的前列腺标本127例，其中62例BPH ，年龄56～86岁，平均69.89岁；65例PCa，年龄53～88岁，平均69.25岁。所有患者均未接受放、化疗或免疫治疗，均经两名资深病理医师采用双盲法判读。PCa组织按Gleason评分以主要分化程度和次要分化程度分别评分，两项评分相加≤4分为高分化组，5～7分为中分化组，8～10分为低分化组。

1.2 试剂与方法Nanog 兔多克隆抗体(浓度1 ∶400、14295-1-AP)、SOX2 兔多克隆抗体(浓度1 ∶400，11064-1-AP)及免疫组化MaxVision 试剂盒，均购自北京中杉金桥公司。石蜡包埋组织连续切片，厚4 μm，免疫组化采用MaxVision 法染色，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，用已知阳性组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断Nanog和SOX2主要表达于细胞核或细胞核/质。(1)根据细胞染色强度评分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)根据阳性细胞染色百分比评分：≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相乘，采用半定量评分标准判断，<6分为低表达，≥6分为高表达。

1.4 统计学分析应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，采用χ2检验分析两组样本间的表达率差异，采用Spearman等级相关分析进行两者之间的相关性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BPH和PCa组织中Nanog的表达Nanog阳性主要定位于正常腺体的上皮细胞核和癌变细胞核或细胞核/质。Nanog在62例BPH组中有12例呈高表达，阳性率为19.4%；在65例PCa组中有26例呈高表达，阳性率为40.0%，两组间差异有统计学意义(χ2=6.450，P<0.05，表1，图1、2)。Nanog在21例转移性PCa组中有17例呈高表达，阳性率为81.0%；在44例非转移性PCa组中有9例呈高表达，阳性率为20.5%；两组间差异有统计学意义(χ2=8.354，P<0.05，表2)。

表1 良性前列腺增生及前列腺癌组织中Nanog和 SOX2的表达

表2 非转移性及转移性前列腺癌组织中Nanog和 SOX2的表达

2.2 BPH和PCa组织中SOX2的表达SOX2阳性主要定位于正常腺体的上皮细胞核和癌变细胞核或细胞核/质。 SOX2在62例BPH组中有11例呈高表达，阳性率为17.7%；在65例PCa组中有24例呈高表达，阳性率为36.9%；两组间差异有统计学意义(χ2=5.848，P<0.05，表1，图3、4)。SOX2在21例转移性PCa组中有14例呈高表达，阳性率为66.7%；在44例非转移性PCa组中有10例呈高表达，阳性率为22.7%，两组间差异有统计学意义(χ2=4.976，P<0.05，表2)。

①②③④

2.3 PCa中Nanog、SOX2表达与临床病理特征的关系PCa组中Nanog和SOX2表达均与TNM分期、有无淋巴结和骨转移相关(P<0.05)；与患者年龄、术前PSA值均无关(P>0.05)。与Nanog不同的是，SOX2表达高低与Gleason评分无关(P>0.05，表3)。

表3 前列腺癌中 Nanog、SOX2表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 PCa中Nanog、SOX2表达的相关性PCa组织中Nanog、SOX2同时高表达18例，同时低表达33例；提示两者的表达呈正相关性(rs=0.297，P=0.003，表4)。

表4 前列腺癌中Nanog和SOX2表达的相关性

3 讨论

PCa的早期阶段行雄激素剥夺治疗被认为是这一时期患者的有效治疗手段。由于PCa具有高度异质性和多灶性的生物学特性，治疗一段时间后多数患者开始对雄激素剥夺出现抵抗，将发展成为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)。CRPC变异体是神经内分泌性前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer, NEPC)，具有高度侵袭性且疗效较差[6-7]。目前寻找雄激素剥夺治疗后的耐药机制及这一阶段有代表性的标志物已引起学者们的极大关注。最近癌症干细胞(cancer stem cell, CSC)理论增加了对癌症发展的理解，据文献报道CSC在不同组织的多种实体瘤中发生[8]，且在PCa恶性程度和肿瘤内异质性形成中有重要作用[9]。肿瘤干细胞理论认为PCa组织具有不均一性，激素治疗可杀死大部分癌细胞，但是这些存活下来的具有致瘤潜力的小部分癌细胞又可随时间的推移而生长，为PCa经过激素治疗后复发转移现象提供了依据[10]。为了延长PCa患者的生存期，在预测转移性PCa可能的致病因素或治疗靶点时，本实验收集具有干细胞特性的Nanog、SOX2蛋白作为分析对象，结果显示在转移性PCa组织中，Nanog、SOX2蛋白的表达远远高于非转移性PCa组和BPH组。

最近研究表明，SOX2与转移性PCa患者的病情发展和预后不良有关。在PCa早期SOX2表达较低，但随着Gleason评分的增加而显著增加[11]。此外，SOX2在大多数淋巴结阳性PCa组织中表达[12]，而晚期PCa中SOX2表达增加与不良生存能力密切相关[11]，与本组结果一致，SOX2在转移性PCa组织中表达较高。Nanog在多种恶性肿瘤中具有自我更新和多能性，在前列腺腺癌细胞中也呈阳性反应[13]。在人类前列腺腺癌细胞中已观察到Nanog、OCT4、SOX、CD44、NESTIN的表达[14]，表明CSC和祖细胞在PCa发生、发展中有重要作用。同时，Nanog和SOX2在预测PCa病程中的价值报道较少。本组检测CSC标志物Nanog和SOX2的表达，结果表明Nanog和SOX2在PCa中的表达明显高于BPH，且与TNM分期、淋巴结转移、骨转移呈正相关。

体外实验显示Nanog与自我更新能力和集落形成活性等恶性指标有关[15]，特别在雄激素敏感性和CRPC细胞系中，Nanog过表达促进实验动物的移植瘤形成。文献报道80%的PCa中存在Nanog mRNA表达[16]。同时，在恶性转化细胞中Nanog基因的水平最高，而BPH中未检测到，表明Nanog可能参与PCa的发生[17]。本组实验中通过对 Nanog蛋白检测，显示 Nanog蛋白的阳性率在PCa组织尤其是转移性PCa组织中明显高于非转移性PCa组织，提示Nanog蛋白表达可能与PCa的发生、发展相关。

SOX2是属于SOXB1组的SOX基因家族成员。SOX2是胚胎发育的关键转录因子，通常被认为是维持胚胎干细胞的多能性和自我更新特性的关键调节剂[18]。有文献报道从早期PCa的特异性基因表达下降就伴随SOX2表达，一直持续到末期NEPC[19]，提示SOX2在驱动NEPC分化中潜在的关键作用。张振宇等[20]分别采用免疫组化、Western blot法及RT-PCR检测SOX2在PCa中表达均明显高于BPH，且与淋巴结转移呈正相关，与本实验结果一致。本组结果表明，SOX2在PCa中尤其是转移性PCa中表达升高，与TNM分期、淋巴结转移、骨转移有关。

本组中Nanog和SOX2在PCa中的表达明显高于BPH，随临床分期和病理分级增加，其阳性率逐渐增高。此外，Nanog阳性率随Gleason评分的增加而增高，与相关报道结果一致，且两者在PCa中的表达呈正相关；提示在PCa发生、发展过程中Nanog和SOX2可能同时被调控，两者之间可能有协同关系影响PCa的进展。因此，作者猜想Nanog和SOX2在PCa的发生、发展中发挥重要作用，联合检测Nanog和SOX2有望成为诊断PCa新的分子标志物，为临床治疗提供新思路。