侵染昆明园林植物的4 个HCRV 分离株核壳体蛋白氨基酸序列分析*

王宇琪 ，吴保为，陶宏征，贾志强，高 雪，王景文，刘雅婷

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201)

朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV) 是泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒，2013 年在中国云南被首次发现并报道[1]，本课题组首次报道了朱顶红褪绿环斑病毒的全基因组序列[2-3]。朱顶红褪绿环斑病毒能系统侵染一点红、番茄、莴苣、旱金莲和豇豆等经济作物，主要症状为同心环纹、叶片畸形、局部褪绿和坏死[4]，对农业生产造成了严重的威胁。HCRV 为三分子基因组，分别是L RNA、M RNA 和S RNA。L RNA 仅有1 个开放阅读框，正向编码RNA 依赖的RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；M RNA 正向编码非结构蛋白(non-structural protein of M RNA，NSm)，互补链编码糖蛋白前体(glycoproteins，Gn/Gc)；S RNA正向编码非结构蛋白NSs (non-structural protein of S RNA，NSs)，互补链编码核壳体蛋白 (nucleocapsid protein，N)[5]，N 蛋白序列保守程度较高[6]，因此通常被用于进行Tospovirus属病毒的分类检测和鉴定[7]，N 蛋白也可能与病毒粒子装配有关[8]。本研究通过RT-PCR 鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草感染HCRV 的4 份样品。为研究核壳体蛋白序列特征，通过RT-PCR、克隆和测序得到样品完整的HCRV S RNA 序列，利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得其N 蛋白序列并进行分析，为HCRV 的后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料采集

2016 年在云南省昆明市主要园林景区进行了调查，采集到八角金盘(Fatsia japonica)、葱莲(Zephyranthes candida)、酢浆草(Oxalis corniculata)、旱金莲(Tropaeolum majus)、蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)、文殊兰(Crinumasiaticum)、喜林芋(Philodendronschott) 和鸢尾(Iris tectorum)等疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品(图1)，主要表现为褪绿、坏死斑和皱缩等症状，将采集回来的样品用RT-PCR 进行鉴定。

1.2 总RNA 提取

采用去除多糖多酚的TransZol Plant (全式金生物技术有限公司，北京)试剂盒提取RNA，以RNA 为模板，采用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (宝生物技术有限公司，大连) 进行反转录合成cDNA。

1.3 RT-PCR 扩增、克隆及测序

利用Primer Premier 6.0 软件，以GenBank中公布的HCRV S RNA 序列(序列号：JX-833564.1)设计引物，S RNA 扩增引物为：F：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAACAAATAATCATACAC-3′；R：5′-AGAGCAATCGAGGTATAAAACATAAATTCTGAAC-3′。50 μL PCR 反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，FastPfu 1 μL，Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32 μL。PCR 反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，50 ℃20 s，72 ℃ 1.5 min，40 个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR 反应产物用于1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将获得的PCR 产物进行纯化以及加A反应。将已纯化的PCR 产物连接在pEASY-T1载体上，将连接产物导入T1 感受态细胞中，经过菌液PCR 鉴定出阳性重组子并送到公司进行测序。

1.4 生物信息学分析

通过ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得4 个HCRV 分离物的N 蛋白序列，利用DNAMAN 8.0 与分离自云南省蜘蛛兰上的HLS1-2 N 蛋白(登录号：AFX74694)进行序列比对分析；利用MEGA 6.06 软件对NCBI 数据库中已公布的分离自云南、广东、广西和福建地区蜘蛛兰上的HCRV 的N 蛋白以及本研究获得的4 个寄主的N 蛋白进行系统进化分析。

图1 疑似感染番茄斑萎病毒属病毒样品Fig.1 Samples suspected infection with Tospovirus virus

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 结果

通过RT-PCR 技术鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4 份感染HCRV 的样品并扩增出HCRV S RNA 序列，电泳检测条带大小约为2 700 bp (图2)。

图2 HCRV S RNA 扩增结果Fig.2 Amplification of HCRV S RNA

2.2 不同株系HCRV N 蛋白序列比对分析

本研究获得的葱莲YN-ZCH、文殊兰YNCA、喜林芋YN-PS 和酢浆草YN-OC 的N 蛋白，通过DNAMAN 8.0 与首个公布的HLS1-2 N蛋白进行序列比对，一致性达到99.34%。YNZCH 存在6 个突变位点，YN-CA 存在5 个突变位点，YN-PS 存在4 个突变位点，YN-OC 存在6 个突变位点(表1)。

2.3 不同株系HCRV N 蛋白系统进化分析

利用MEGA 6.06 软件对NCBI 数据库中已公布的HCRV 的N 蛋白以及本研究获得的4 个寄主的N 蛋白构建系统发育树，建树方法选择邻接法(neighbor-joining，NJ)。结果显示：本研究获得的4 个HCRV 分离物的N 蛋白与分离自云南省的HCRV N 蛋白聚为1 支，来自广东、广西和福建地区的聚为1 支(图3)。

表1 氨基酸突变位点Tab.1 Amino acid mutation sites

3 讨论

云南省丰富的植物资源和复杂的气候以及丰富的传播介体种类为Tospovirus病毒的发生和流行提供了条件，该属病毒在云南的发生呈逐年上升趋势[9]。自2013 年首次在云南省发现HCRV至今，国内外对其研究较少，目前已知寄主包括蜘蛛兰、烟草、番茄、君子兰[10]和葱莲[11]等，仍有许多寄主尚未被发现。本研究鉴定出葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草4 个感染HCRV 样品，其中文殊兰、喜林芋和酢浆草是首次报道的HCRV寄主。研究结果表明：4 个HCRV 分离物的N 蛋白与NCBI 首次公布的HLS1-2 N 蛋白有较高的同源性，从系统发育分析可知不同株系的分离物聚类现象与寄主无明显关联，推测可能环境因子对病毒进化的影响强于寄主的影响。

图3 HCRV N 蛋白氨基酸序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of HCRV N protein amino acid sequence

4 结论

本研究通过采集疑似感染番茄斑萎病毒属病毒的样本，应用症状学和分子生物学方法鉴定出了葱莲、文殊兰、喜林芋和酢浆草 4 个感染HCRV 样品，对 4 个寄主植物 S RNA 序列中 N蛋白进行序列比对和系统进化分析，结果表明4 个HCRV 分离物 N 蛋白与 NCBI 公布的 HLS1-2 N 蛋白有较高的同源性，HCRV 病毒的地理分布相关性强于寄主相关性。研究结果为 HCRV 的进化研究提供基础，也为进一步探究番茄斑萎病毒属病毒的扩散和进化策略提供参考。