耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展

郑 茂， 邹 玉， 刘 晓，袁成良

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是临床常见的条件致病菌，可引起肺部感染、尿路感染以及血流感染等多种疾病，严重时还可引起脓毒血症、化脓性脑膜炎等致死率极高的危急重症[1]。伴随荚膜多糖的差异和细菌毒力的变迁，肺炎克雷伯菌还进化出新变种——高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）。hvKP具有独特的表型特征（如高黏液型、特殊血清型）和基因型特征（如携带特殊的毒力基因），临床致病力更强，不仅可以导致免疫功能低下的患者感染，还可以使免疫功能正常的年轻人群发生重症社区获得性感染，如肝脓肿、化脓性眼内炎、化脓性脑膜炎甚至骨髓炎等，并可呈现迁徙性播散[2]。传统研究观点认为，高毒力和多重耐药在hvKP基因组上没有重叠，大部分hvKP对常用抗菌药物（氨苄西林除外）保持高度敏感，耐药率极低，故临床针对hvKP感染可进行及时有效治疗[3]。碳青霉烯类抗生素是目前治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBL）、头孢菌素酶（AmpC）等多重耐药菌所致重症感染的一线用药，但随着临床广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）检出率呈逐年上升的态势，特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CR-KP）上升幅度明显[4-5]。以其高毒力和高耐药汇聚在同一种细菌，成为“超级细菌”，耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌（carbpenem-resistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）的出现，给全球公共卫生及临床抗感染治疗带来极大挑战[6]。本文对近年来CR-hvKP的研究进展作综述。

1 CR-hvKP的流行情况

上世纪八十年代，我国台湾地区首次报道hvKP感染引起肝脓肿病例后，hvKP逐渐成为临床关注的重点。亚洲地区尤其是中国hvKP感染率非常高，肺炎克雷伯菌临床分离株中超过三分之一为高毒力株，地理分布呈多样性[3]。近年来，由于碳青霉烯类耐药基因和耐药质粒的传播，全球各地陆续出现CR-hvKP的报道。2014年，阿根廷Cejas等[7]报道从老年患者中分离的1株CR-hvKP，该菌株携带多种耐药基因和毒力基因，在南美洲属首次分离，患者最终因多种基础疾病及感染恶化而死亡。2016年，印度连续报道携带NDM-1、OXA-232、OXA-181、OXA-1的4株CR-hvKP全基因组序列，分别来源于不同血流感染和尿路感染的患者[8-9]。2017年，意大利Arena等[10]报道1株分离自肝脓肿继发血流感染患者的CR-hvKP，并详细描述了其临床流行病学和遗传学特征。2018年，伊朗Mohammad等[11]报道德黑兰一家医院ICU内实施机械通气的5例患者暴发CR-hvKP医院感染，并导致4例患者死亡。2019年，美国Karlsson等[12]报道从门诊患者尿液标本中分离的1株CR-hvKP，该菌株携带多种毒力基因。2020年，新加坡Chen等[13]对住院患者的556株CR-KP进行回顾性调查，分离到来源于7例患者的18株CR-hvKP，所有菌株均携带pKPC-2耐药质粒。

相对于全球其他地区的CR-hvKP感染情况，中国的CR-hvKP感染蔓延趋势更为严重，已成为CRE研究的热点问题。2015年，北京大学Zhang等[14]进行的一项全国多中心流行病学调查，首次从血液样本中分离出1株高黏液性肺炎克雷伯菌，亚胺培南对其MIC＞32 mg/L，鉴定为CR-hvKP，该菌株产ESBL伴外膜孔蛋白OmpK35/36低表达，携带多种毒力基因，与CR-KP非高毒力株相比表现出更高的血清抗性及小鼠致死率。此后，北京、上海、江西、浙江、四川、湖南等多省市陆续出现CR-hvKP的研究报道[15-20]。

2020年，Zhang等[21]再次报道一项全国多中心、纵向监测CR-hvKP的研究，对2015－2017年全国56个中心的CR-KP进行回顾性调查，从1 052株CR-KP中鉴定出55株CR-hvKP；各地区的菌株构成比差异较大，在山东、河南检出的CR-KP中，CR-hvKP占比甚至高达25.8%（25/97）、25.4%（17/67）；另外，在产KPC-2酶的ST11型CR-KP中，CR-hvKP占比亦从2015年的2.1%（3/141）上升至2017年的7.0%（23/329）。由此可见，CR-hvKP在中国的流行形势日趋严峻。

2 CR-hvKP的分子特征及毒力特征

根据荚膜多糖结构和抗原性不同，可将肺炎克雷伯菌分为至少82个荚膜血清型，其中Kl、K2、K5、K20、K54和K57是hvKP的独特血清型，故也是CR-hvKP的特征性血清型，与其引起的各种侵袭性感染密切相关。多位点序列分型（MLST）是一种基于核酸序列的细菌分型方法，可将CR-hvKP分为多种ST型，常用于分析菌株的分子流行特征。近年文献中涉及CR-hvKP详细分型总结于表1。目前的研究数据显示CR-hvKP的血清型以Kl、K2最常见，其次是K47、K64，其他少见血清型如K20、K54、K62也有个别报道。CR-hvKP的ST分型以ST11、ST23最常见，其他如ST25、ST29、ST36、ST65、ST86、ST268、ST1797等也有少量报道。CR-hvKP的不同血清型与ST分型之间表现出一定程度的相关性，K1血清型以ST23为主，K2血清型以ST65、ST86为主，K47、K64血清型则均以ST11为主。

CR-hvKP的毒力特征多与hvKP相同，其高毒力的物质基础是荚膜多糖和铁载体系统。荚膜多糖使CR-hvKP可以抗中性粒细胞吞噬作用以及抗血清补体杀菌活性，涉及的毒力基因包括rmpA、magA、wcaG等。铁载体系统对于CR-hvKP的生长繁殖至关重要，同时也是其重要的毒力因子，涉及的毒力基因包括aerobactin、ybt、ent、kfu、iuc、iro等。此外，细菌菌毛介导与宿主细胞接触或黏附于黏膜表面，是CR-hvKP感染机体的重要介质，涉及的毒力基因包括fim、mrk等。如表1所示，目前文献报道的CR-hvKP均携带多种毒力基 因。

除携带毒力基因外，CR-hvKP通常还携带碳青霉烯类耐药基因，所编码的碳青霉烯酶是一种能水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶，在Ambler分子分类法中属于A、B、D类酶。A类酶编码基因包括KPC、NMC、SME等；B类酶又称为金属酶，编码基因包括NDM、IMP、VIM等；D类酶为苯唑西林酶（OXA），对碳青霉烯类水解效率较低[4]。由表1数据可知，KPC-2、NDM-1是CR-hvKP最常见的碳青霉烯类耐药基因，主要流行于ST11型菌株；VIM-1、VIM-2、OXA-232等在CR-hvKP中也有携带，但比例相对较低，主要流行于ST23型菌株。以往文献多报道CR-hvKP仅携带单一碳青霉烯类耐药基因，但随着研究的深入和全基因组测序的普及，Wei等[22]、Liu等[23]还报道1株同时携带KPC-2和NDM-1的CR-hvKP，并获得其完整的基因组序列；该菌株分离自1例老年男性的烧伤患者，表现出泛耐药特征，对包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南在内的所有β内酰胺类，以及喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和大环内酯类均耐药。

3 CR-hvKP的碳青霉烯类耐药机制

产碳青霉烯酶是造成肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，其编码基因位于细菌质粒或染色体上，通过转座子或结合性质粒等移动元件在菌株与人群之间广泛传播。2016年，Rafiq等[9]报道1株CR-hvKP存在OmpK36膜孔蛋白突变，使其在缺乏碳青霉烯类耐药基因的情况下出现对碳青霉烯类耐药的现象。2018年，Gu 等[26]报道浙江某大型医院ICU内发生由CR-hvKP引起的呼吸机相关性肺炎的医院感染，导致5例患者死亡；深入研究证实所有CR-hvKP均为同一个ST11型克隆株，其高毒力通过获得约170 kbp大小的pLVPK-like毒力质粒进化而产生，当消除该质粒后其毒力大幅下降。2019年，Shen等[38]报道1株产NDM-5酶的ST35型CR-hvKP，该菌株在小鼠腹膜炎感染模型中表现出明显的抗血清杀菌和抗中性粒细胞吞噬能力，但不携带pLVPK-like毒力质粒，而是在特定的天冬酰胺-tRNA基因中发现了ICEKp1染色体整合，从而编码多种毒力基因（iroBCDN、rmpA等）。通过对文献数据的分析，CR-hvKP的碳青霉烯类耐药机制可能存在3种途径：①CR-KP非高毒力株获得hvKP携带的毒力基因质粒，如pLVPK-like毒力质粒[26-27]；②hvKP获得编码碳青霉烯酶的质粒进化为CR-hvKP[14，39-40]；

③hvKP在碳青霉烯类抗生素压力诱导下外膜孔蛋白发生变异，产生耐药表型[9，14]。

表1 近年来文献报道的CR-hvKP的分子特征及毒力基因

质粒在推动碳青霉烯类耐药的全球快速传播和适应性变化方面发挥着关键作用，针对CR-hvKP携带的毒力质粒及耐药质粒，香港理工大学开展了系统深入的研究。2018年，Dong等[41]利用纳米孔测序技术获得3株CR-hvKP的全基因组序列，确定了菌株携带质粒的独特遗传特征，发现非结合性毒力质粒与带有结合性KPC-2的耐药质粒之间存在同源区域，提示毒力质粒从ST23型hvKP到ST11型CR-KP的传递可能是通过这两个质粒的共整合转移来实现。这是首次证实质粒携带的碳青霉烯类耐药基因可在hvKP传播，并仍可保持其高毒力特性。此后，该团队还首次发现混合编码rmpA2和KPC-2的杂交质粒[42]，这种质粒是由IS26介导KPC-2和dfrA耐药性移动元件插入毒力质粒而形成，具有同时介导高耐药和高毒力表型的能力，这种新兴质粒在肺炎克雷伯菌中传播将导致CR-hvKP感染率显著升高。2019年，Dong等[43]报道1株携带3个质粒的ST11型CR-hvKP，包括1个pLVPK-like毒力质粒和2个多重耐药质粒（pKPCCR-hvKP、pCTX-M-CR-hvKP），多重耐药质粒来源于单个pKPC-CR-hvKP-like质粒的同源重组；KPC-2基因被串联定位在具有NTEKPC-Id-like结构的非结合性质粒上，推测该质粒可能是Tnp26通过催化可移动元件的活性进行保守反应的结果，表明ST11型CR-hvKP克隆中的质粒可以发生活跃的基因重组。同年，Dong等[35]还报道1株ST23型CR-hvKP，该菌株含有3个抗药性编码质粒（pR210-2-vir、pR210-2-VIM、pR210-2-CTX），其中携带VIM-1的质粒具有可能由多个基因动员事件产生的嵌合体结构，表明hvKP通过基因水平转移主动获得了可移动的抗性编码元件，促进超强毒力和碳青霉烯类耐药性在CR-hvKP中同时表达。此外，Yang等[40]还发现一种可结合性毒力质粒（p15WZ-82-vir），这类质粒可与CR-KP结合，使其能同时表达高毒力和碳青霉烯类耐药性，与非结合性pLVPK质粒不同，可结合性毒力质粒的出现可能会促进革兰阴性细菌中毒力编码元件的快速传 播。

在hvKP与质粒相互作用方面，Long等[44]还报道了携带NDM质粒的hvKP全局转录反应，位于质粒pLVPK上的毒力相关基因下调是这种转录反应的主要特征。hvKP对碳青霉烯酶编码质粒的应答是通过改变糖代谢、抗生素耐药性、荚膜生物合成等相关基因表达来实现，该研究证实携带碳青霉烯类耐药基因的质粒除了具有耐药性选择优势外，还可能导致hvKP的毒力改变或对特定环境的适应。

4 CR-hvKP的抗菌治疗

尽管CR-hvKP表现出泛耐药特性，但仍然对少数几种抗菌药物保持敏感，如替加环素和黏菌素[33]。然而，有研究显示长期使用替加环素或黏菌素（单独或与几种其他抗生素组合）治疗不能根除产KPC-2酶的ST11型CR-hvKP[26]。值得注意的是，已有对替加环素或黏菌素耐药的CR-hvKP报道出现。Gu等[45]从患者肠道中分离出的ST11型CR-hvKP，检测到同时携带tet(A)、KPC-2的质粒，其中acrA、acrB、ramA基因过表达，导致菌株对替加环素出现耐药。Huang等[27]从1例腹腔内脓肿死亡患者中分离到1株ST11型CR-hvKP，该菌株携带含多种毒力基因的pLVPK-like质粒，除对碳青霉烯类耐药外，对替加环素和黏菌素也耐药。因此，CR-hvKP感染对有效抗生素的需求迫在眉 睫。

头孢他啶-阿维巴坦是一种新型头孢菌素-β内酰胺酶抑制剂复合剂。国外一项多中心、前瞻性研究显示治疗CR-KP引起的CRE感染，头孢他啶-阿维巴坦比黏菌素更有效，可明显改善患者临床结局，尤其是降低医院死亡率[46]。Yu等[47]首次检测了头孢他啶-阿维巴坦和其他抗生素对65株CR-hvKP的抗菌活性，结果显示头孢他啶-阿维巴坦、黏菌素和替加环素在体外对CR-hvKP均具有很高的抗菌活性（MIC90≤1 mg/L），包括对产KPC-2酶的ST11型CR-hvKP，该研究表明头孢他啶-阿维巴坦可能是治疗CR-hvKP的合理选择。

5 结语及展望

CR-hvKP在全球范围内呈现愈演愈烈的蔓延趋势，该菌株既表达毒力因子，又携带耐药基因，一旦广泛播散，将极大地增加临床治疗难度。研发有效的抗菌药物是临床控制CR-hvKP感染的有效手段，而探究其高毒力相关基因及耐药基因的获得机制，或将成为研发新型治疗及抑制其传播药物的有效途径。目前预防CR-hvKP传播的关键是加强主动监测，通过全面感染控制措施遏制其传播，重点是防止医院内传播。