益生菌对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜的保护作用及回肠差异表达蛋白的影响

李东伦 苏 松 甘元涛 赵少勇 郑英俊 淦 宇 方 程 李 波

(1 西南医科大学附属医院肝胆外科，四川省泸州市 646000，电子邮箱：123509627@qq.com；2 四川省乐山市人民医院肝胆外科，乐山市 614000；3 四川省宜宾市第二人民医院肝胆外科，宜宾市 644000)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是临床常见的急危重症，若未得到及时有效的治疗，最终可能导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1]。目前，大多数学者认为，肠道黏膜屏障损伤所致肠道通透性升高引起菌移位是SAP并发胰周感染的主要机制[2]。有关SAP发生时肠道菌群改变引起肠道黏膜损伤的研究较多[3]，但肠道黏膜损伤相关特异性表达蛋白的研究报告较少。本研究通过建立SAP大鼠模型，然后给予益生菌治疗，再用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术[4]来筛选相关差异蛋白，以探讨SAP发生时肠黏膜屏障损伤的机制，从而为SAP治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应试剂厂)，牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)，双歧杆菌四联活菌片(杭州龙达新科生物制药有限公司)，血清淀粉酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，iTRAQ 8-plex标记试剂盒(美国AB SCIEX公司)。高速冷冻离心机(美国Sigma公司)，Bio-Rad电泳系统(美国Bio-Rad公司)，高分辨质谱系统TripleTOFTM5600(美国AB SCIEX公司)，全波长酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 实验动物 SD大鼠24只，8周龄，体重为250～300 g，实验动物及专用饲料均由西南医科大学实验动物中心提供[许可证号SYXK(川)2013-181]，大鼠分笼喂养，适应性喂养1周后开始实验。

1.3 建模及干预方法 (1)分组：将大鼠按随机数字表法分成SO组、ANP组和PRO组，每组8只。(2)建模及干预方法：ANP组及PRO组大鼠在造模前禁食12 h，可自由饮水，每只SD大鼠予以3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，将大鼠仰卧位固定于手术操作台上。行大鼠上腹部正中切口，入腹后先找到胰胆管，然后在十二指肠外侧壁用5号针头逆行插入胆胰管，匀速注射3%牛磺胆酸钠(用灭菌生理盐水稀释)。逐渐可见胰胆管周围肿胀，局部胰腺颜色慢慢变黑、水肿伴充血，可初步判断SAP大鼠模型造模成功，仔细缝合伤口，关腹[5]，术后继续禁食，但不禁水。PRO组建模成功后，立即予以低温(4℃)保存的益生菌制剂溶液[双歧杆菌四联活菌片(5 g)捣碎研磨成粉，加入无菌生理盐水中，溶解后定容至50 mL，配制成10%的浓度]灌胃，剂量为1 mL/100 g,2次/d[6]。SO组为假手术组，行SD大鼠上腹部正中切口，开腹找到胰腺，翻动数次后，仔细缝合伤口，关腹，术后继续禁食，但不禁水。

1.4 观察指标 (1)血清淀粉酶：于造模后24 h、48 h各组分别取8只大鼠，每次经心脏采血2 mL，室温血液自然凝固10～20 min，2 000～3 000/min离心20 min，收集上清液，使用淀粉酶测定试剂盒检测血清淀粉酶水平。(2)胰腺组织病理学：造模后48 h各组取8只大鼠，腹腔麻醉后取胰腺组织，制作组织切片后行苏木精-伊红 (hematoxylin-eosin，HE)染色，再根据Schimidt评分标准[7](见表1)进行胰腺组织病理评分。(3)小肠黏膜组织病理学：取好胰腺组织后，在距回盲部10 cm处取约5 cm的肠段，分成两块，一块放入-80℃冰箱超低温保存用于蛋白提取，另一块经HE染色后，参照Chiu氏评分表[8](见表2)评估小肠黏膜的损伤程度。(4)差异蛋白的筛选：取回肠组织标本加入裂解液(含7M尿素，2M硫脲，0.1%种蛋白酶抑制剂，65mM二硫苏糖醇)，1 200 r/min离心15 min、酶解，最后加入iTRAQ试剂，1 200 r/min离心20 min干燥冷冻待用。采用高分辨质谱系统-TripleTOFTM5600进行蛋白质分析，采用ProteinPilot软件进行检索，采用NCBI nr数据库进行鉴定，选出明显差异表达的蛋白(置信度在95%以上)。

表1 Schimidt评分表

表2 Chiu氏评分表

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验或方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。分别采用P<0.05且差异倍数(fold change,FC)>1.5筛选差异蛋白。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清淀粉酶水平比较 造模后24 h、48 h 3组大鼠血清淀粉酶水平比较差异均具有统计学意义，SO组、PRO组、ANP组血清淀粉酶均依次升高(均P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠血淀粉酶水平比较(x±s,U/L)

2.2 3组大鼠胰腺病理组织学表现及病理评分比较 肉眼观SO组胰腺组织基本正常，ANP组与PRO组胰腺组织有不同程度的出血、水肿、散在小片状皂化斑，见图1。ANP组和PRO组胰腺病理评分高于SO组(均P<0.05)，见表4。

图1 3组胰腺组织病理学改变(HE染色)

表4 3组大鼠胰腺和回肠组织病理评分比较(x±s，分)

2.3 3组大鼠回肠病理组织学表现及病理评分比较 HE染色结果显示，ANP组回肠组织出现肠黏膜和绒毛轻度破损，与固有层无分离，固有层轻度瘀血，细胞成分较多；PRO组回肠组织肠黏膜和绒毛无破损，与固有层无分离，固有层轻度瘀血；SO组回肠组织肠黏膜和绒毛无破损，与固有层无分离，固有层无瘀血。见图2。ANP组回肠组织病理评分高于SO组、PRO组(均P<0.05)，见表4。

图2 3组回肠组织病理学改变(HE染色)

2.4 差异蛋白的筛选结果 ANP组和SO组共筛选和鉴定出49个差异表达的蛋白，与SO组比较，ANP组有12种蛋白表达上调，37种蛋白表达降低。PRO组和SO组共筛选和鉴定出107个差异表达的蛋白，与SO组比较，PRO组有6种蛋白表达上调，101种蛋白表达降低。两组差异蛋白均包含双皮质醇样激酶1(double cortin-like kinase 1,Dclk1)、半乳糖凝集素-1(galectin-1,Gal1)、转胶蛋白、钙调理蛋白-1(calponin 1,Cnn1)、ⅣC型磷脂酶A2(phospholipase A2 group ⅣC,Pla2g4c)、伴侣蛋白10、免疫球蛋白M重链(immunoglobulin heavy constant Mu,Ighm)、联丝蛋白(synemin,Synm)、肠凝集素1(intelectin 1,Itln1)、胞浆型磷脂酶A2γ(cytosolic phospholipase A2 gamma,cPLA2γ)、活化b细胞RT1Blα链。

2.5 差异表达蛋白的生物信息学分析

2.5.1 差异表达蛋白基因本体分析：(1)ANP组和SO组49个差异表达的蛋白中有51%的差异蛋白参与生物过程，16%参与分子功能，33%为细胞成分的组成部分。这些差异表达蛋白涉及的生物学过程有信号传导、代谢、免疫应答、细胞运动、蛋白结合、载体活性、结构分子活性、分子转导活性、催化活性、调控因子等，其主要参与组织代谢等生物过程，涉及蛋白结合、分子转导活性等分子功能，主要定位于细胞膜、细胞器、大分子复合物等细胞成分。(2)PRO组与SO组107个差异蛋白中有47%的差异蛋白参与生物过程，21%涉及分子功能，32%为细胞成分的组成部分。差异表达蛋白涉及的功能有信号传导、代谢、免疫应答、细胞运动、蛋白结合、电子载体活性、抗氧化剂活性、转运体活性、结构分子活性、分子传导活性、调控因子等，其中主要参与信号转导、免疫应答等生物过程，涉及调控因子等分子功能，主要定位于细胞膜、突触结构等细胞成分。

2.5.2 差异表达蛋白的通路分析：(1)ANP组和SO组中49个差异表达蛋白主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路、寄生虫侵袭及炎症相关的通路、代谢相关的信号通路等。(2)PRO组与SO组中107个差异表达蛋白主要涉及磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、内/外分泌系统相关过程及代谢相关的信号通路等。

2.5.3 差异表达蛋白的蛋白质相互作用网络：(1)图3为ANP组与SO组差异表达蛋白的蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图，图中每个球体表示一种蛋白质，中间区域核心节点处的蛋白研究价值最大，分别为Dclk1、活化b细胞RT1B1α链(activated B cell RT1B1 alpha chain,RT1-Ba)、Cnn1、Ⅰ型胶原α1链(collagen type Ⅰ alpha 1 chain,Col1a1)、热休克蛋白B族(小)成员1[heat shock protein family B(small)member 1,Hspb1]等。(2)图4为PRO组与SO组差异表达蛋白的PPI网络图，位于核心节点处的蛋白有热休克蛋白A族(小)成员5[heat shock protein family A(small)member 5,Hspa5]、脯氨酸4-羟化酶β亚基(prolyl 4-hydroxylase subunit beta,P4hb)、FKBP脯氨酸异构酶1A(FKBP prolyl isomerase 1A,Fkbp1a)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,Pgk1)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,Mdh)1、Mdh2、蛋白酶体20s亚基β2(proteasome 20S subunit beta 2,Psmb2)等。(3)最终在ANP组与SO组、PRO组与SO组的差异蛋白中筛选出关联性最强的蛋白质有胶转蛋白、Gal1。

图3 ANP组与SO组差异表达蛋白PPI网络图

图4 PRO组与SO组差异表达蛋白PPI网络图

3 讨 论

大多数研究者认为，SAP后的菌移位引起肠道黏膜屏障损伤而所致的肠道通透性升高，是SAP并发胰周感染的主要机制[2]。而益生菌应用于SAP并发胰周感染的疗效也得到了临床的肯定[9]。近年来随着生物信息学的高速发展，生物医学的研究跨入了基因时代，在疾病发生和发展的过程中，蛋白质作为承载基因的载体扮演着极其重要的角色，因此针对蛋白质的研究热度与深度也日益提高[4]。蛋白质组学为大多数疾病的发生和发展机制研究提供了新的思路[9]。研究发生SAP时肠黏膜屏障损伤的差异表达蛋白，对治疗SAP并发胰周感染有重要意义。

我们的前期实验结果显示，益生菌能够减轻SAP发生时肠黏膜的损伤程度，提示益生菌对SAP后的肠黏膜具有保护作用。此外有研究显示，益生菌减轻肠黏膜炎症的作用与某些差异表达蛋白有关，具体机制可能与差异蛋白重组蛋白质导致细菌移位或者调控免疫功能从而减少炎症反应有关[10]。为进一步探索SAP发生时肠黏膜屏障损伤的机制，我们建立SAP大鼠模型，并给予益生菌干预，结果显示，与ANP组比较，PRO组大鼠的肠黏膜和绒毛损伤程度减轻，血淀粉酶水平以及回肠的病理评分降低，提示益生菌不仅有利于降低血清淀粉酶水平，且对肠黏膜具有保护作用。

我们进一步采用生物信息学分析筛选出差异表达的蛋白，结果显示，与SAP发生时肠黏膜屏障损伤有关的差异表达蛋白可能有Gal1、转胶蛋白、Cnn1、Pla2g4c、伴侣蛋白10、Ighm、Synm、Itln1，其中转胶蛋白、Gal1关联性最强。分析其可能的参与机制为：(1)转胶蛋白是肌动结合蛋白钙调蛋白家族中的成员之一[11]，其可抑制间质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)的表达进而抑制炎症发展[12]，而MMP9是一种参与机体重组过程的酶，重组后可导致癌细胞的运动、细菌的移位。(2)Gal1是半乳糖凝集素家族的成员之一，其可以通过调节机体免疫应答来影响炎症及免疫功能[13]。Gal1通过促进CD8+T淋巴细胞、辅助T细胞1和辅助T细胞17的凋亡，抑制促炎因子白细胞介素2和γ-干扰素的分泌来减轻炎症反应，同时还分泌抗炎因子白细胞介素10和转化生长因子来抑制炎症反应[14-16]。但是该蛋白具体通路以及在肠黏膜损伤中的具体机制仍需进一步研究探索。

综上所述，益生菌对SAP大鼠的肠黏膜损伤具有一定的改善作用，其可能通过调节差异表达蛋白的表达减轻SAP所致的肠黏膜损伤，但相关蛋白具体通路机制并不是很明确，仍需进一步探索与研究。