基于系统药理学鸦胆子治疗肺癌作用机制的研究▲

黄志汉 黎文杰 郑景辉

(1 广西大新县中医医院呼吸内科，大新县 532300，电子邮箱：huangzhihan163@163.com；2 广西中医药大学附属瑞康医院心内科，南宁市 530000)

据国家癌症中心统计，2019年我国肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位，其中新发病例约78.1万，死亡病例约62.6万[1]。目前肺癌的主流治疗方案仍是以化疗为主的综合治疗方案，但由于耐药性强等原因治疗效果并不理想[2]。中药因具有高效、低毒、多靶点的优势，在肺癌耐药性研究中优势日益明显[3]。鸦胆子为苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实，具有清热解毒、截疟、止痢的功效。现代药理学研究表明，鸦胆子具有广泛的抗癌作用，并可以抑制肿瘤的转移[4]。但是由于中药多因、多效、多靶点的特点，鸦胆子治疗癌症的具体作用机制尚未被阐明。本研究利用系统药理学方法综合阐释鸦胆子治疗肺癌的可能机制。

1 资料与方法

1.1 鸦胆子的化学成分 本研究采用药代动力学特征和毒性计算方法，借助中药系统药理学数据库与分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索鸦胆子所有化学成分，以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18筛选鸦胆子的活性成分，最后得到相关化合物以及其相关靶点。将靶点名称输入UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中统一为规范基因名；剔除不同化合物预测产生的相同靶点，得出鸦胆子化合物潜在靶点信息。

1.2 蛋白质互相作用网络的构建 将1.1所得的靶点上传至STRING数据库v10.5(http://string-db.org)，选择以人为分类的物种，设定打分值为高置信度0.7，隐藏断裂节点，得出蛋白质互相作用(protein-protein interaction,PPI)信息，将得到的数据导入Cytoscape 3.6.1软件构建鸦胆子化合物靶点PPI网络。

1.3 鸦胆子治疗肺癌潜在靶点筛选 本研究基于GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)综合筛选与肺癌相关的靶点，具体操作如下：以“lung cancer”作为关键词在GeneCards数据库中查询，初步筛选出20 650个候选基因，根据“Reference Count”值取相关度大于30的靶点。将构建的肺癌相关靶点数据库与鸦胆子化合物潜在靶点进行对比分析，并利用Venny 2.1在线工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/)绘制韦恩图，筛选出鸦胆子治疗肺癌的潜在靶点。

1.4 鸦胆子治疗肺癌潜在靶点的连通特性 根据1.1和1.3的预测结果,利用Cytoscape 3.6.1软件中的Merge功能,将两个预测结果合并成化学成分-靶点-疾病网络图,进行全局化可视网络分析；并通过Cytoscape 3.6.1软件的Network analysis插件计算网络的拓扑参数,分析其相互关系。网络中节点(node)之间如存在调控作用关系则以边(edge)相连。本研究通过平均最短路径、介数中心性、中心接近度、聚类系数和连通度等参数来评估节点在全网络中的关键性。

1.5 生物学功能和通路富集分析 将鸦胆子作用于肺癌潜在相关靶点的官方简写上传到DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中，依次勾选OFFICIAL_GENE_SYMBOL(官方基因标志)、Gene list、Submit list,修改背景和物种为人类进行基因本体(Gene Ontology，GO)分析。选择“KEGG-Pathway”得到京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析相关数据，将数据导入GraphPad Prism 7.0软件进行可视化分析。

2 结 果

2.1 鸦胆子的活性成分及其潜在靶点间的的PPI网络图 共得到13个鸦胆子的化学成分，包括β-谷甾醇、鸦胆子素、矢车菊甙、木犀草素、鸦胆子苷等，见表1。删除无相关对应靶点的化学成分，得到鸦胆子有效活性成分2个，分别为β-谷甾醇和木犀草素，共分析得到48个最终潜在靶点进行下一步研究。鸦胆子有效化合物靶点图及其PPI网络分别见图1、图2。

表1 鸦胆子的化学成分

图1 鸦胆子化合物靶点图

图2 鸦胆子作用靶点的PPI网络图

2.2 鸦胆子治疗肺癌的潜在靶点 共获得321个肺癌相关靶点。将48个鸦胆子的潜在靶点与肺癌靶点进行对比分析，得到鸦胆子治疗肺癌的20个潜在靶点，分别为TP53、JUN、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)2、前列腺素g/h合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、雄激素受体(androgen receptor，AR)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)、孕酮受体(progesterone receptor，PGR)、干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)、MMP1、IL-2、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)、肝细胞生长因子受体MET、视网膜母细胞瘤相关蛋白RB1、谷胱甘肽S-转移酶P1(glutathione S-transferase P1，GSTP1)、DNA拓扑异构酶1(DNA topoisomerase 1，TOP1)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2，BCL-2)，重合率为5.7%，见图3。鸦胆子对肺癌作用靶点的蛋白互作网络见图4。经拓扑学分析，发现这20个潜在靶点在全局性关系网络中体现了较好的连通特性。见表2。

图3 鸦胆子的潜在靶点与肺癌作用靶点的韦恩图

图4 鸦胆子-肺癌作用靶点的PPI网络图

表2 20个鸦胆子-肺癌作用靶点的拓扑学分析

2.3 鸦胆子治疗肺癌潜在靶点的生物学功能和通路分析 将20个鸦胆子治疗肺癌潜在靶点上传至DAVID数据库中进行GO分析和KEGG分析。GO分析结果得到7个生物学过程、11个细胞组成、22个分子功能，见图5；通路富集KEGG分析获得37条鸦胆子治疗肺癌潜在靶点的通路，见图6。

图5 鸦胆子-肺癌作用靶点的GO分析结果

图6 鸦胆子-肺癌作用靶点的KEGG富集分析结果

2.4 鸦胆子治疗肺癌潜在靶点分子对接结果 系统分子对接结果显示，有4个靶点的DS值>7.0，超过90%靶点的DS值>5.0，说明鸦胆子主要化学成分β-谷甾醇与木犀草素对鸦胆子治疗肺癌潜在靶点有较好的结合活性。见表3。

表3 鸦胆子治疗肺癌潜在靶点分子对接结果

3 讨 论

中医上认为肿瘤的发生多是由于邪毒趁机体正气虚弱之时侵入，引起脏腑功能失调，机体气滞血瘀时间过长，逐渐诱发肿块形成。放化疗治疗虽可肿瘤产生一定作用，但副作用过大，对机体损害大，甚至可引起攻邪伤正发生，严重影响患者的生存质量[6]。中医药辅助治疗肺癌副作用较小，但是中药的具体成分难以简单辨别，具体作用机制也难以清楚阐释。系统药理学协同起效的观念与中医上“整体观”相吻合。本研究采用系统药理学方法，利用化合物映射靶点的方法系统探究鸦胆子治疗肺癌的具体作用机制。

本研究筛选出β-谷甾醇、鸦胆子素、木犀草素、鸦胆子苷等鸦胆子的主要化学成分，且得到48个最终潜在靶点。现代药理学研究表明，鸦胆子素是鸦胆子中发挥抗肿瘤作用的主要成分，其中单体鸦胆子素D不仅能够诱导胰腺癌细胞的凋亡，还能够抑制结肠癌细胞的增殖并诱导其凋亡[7-8]。β-谷甾醇作为广谱抗癌成分，在治疗乳腺癌、结肠癌、前列腺癌方面均具有较好的疗效[9]。林明珠等[10]在小鼠实验研究中发现，β-谷甾醇可通过介导IL-6、IFN-γ和VEGF表达促进肿瘤组织细胞的凋亡。木犀草素对非小细胞肺癌细胞的转移及侵犯具有良好的抑制作用[11]。周亮等[12]发现，木犀草素可显著降低CD8+T淋巴细胞水平，降低肺组织中表皮生长因子、转化生长因子β、VEGF的表达及蛋白激酶B1、细胞周期蛋白D1、核因子κB mRNA的表达水平，提高肺组织中PTEN蛋白的表达，降低磷脂酰肌醇3-激酶、磷酸化蛋白激酶蛋白B表达水平，提示木犀草素可显著抑制肺癌的增殖和转移。

在对鸦胆子作用于肺癌的相关靶点进行筛选时，发现有20个鸦胆子有效化合物的潜在靶点与肺癌靶点重合；将这20个靶点进行GO、KEGG分析，结果显示，有7个生物学过程、11个细胞组成、22个分子功能及37条通路参与鸦胆子作用于肺癌的过程，包括癌症中的微小RNA、癌症的信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路、低氧诱导因子1α信号通路等都与肺癌具有高度相关性。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路在非小细胞肺癌的发生发展中具有双重作用：一方面通过促进肿瘤细胞增殖和迁移导致肿瘤进展；另一方面通过参与免疫抑制微环境的形成介导肿瘤细胞的免疫逃逸[13]。该通路抑制剂通过对抗免疫抑制的形成，重塑肿瘤免疫微环境，抑制肿瘤进展[14]。由于肿瘤细胞具有很强的增殖、转移能力，容易导致血液供应不足，此时肿瘤细胞会上调低氧诱导因子1α表达来维持肿瘤细胞的增殖代谢，从而适应缺氧微环境[15]。低氧诱导因子1α能通过调节多种靶基因的转录来影响肿瘤细胞的代谢、增殖、凋亡，使得肿瘤细胞更好地适应缺氧微环境；同时其还具有促进肿瘤血管生成、增加侵袭转移能力以及提高对放化疗抵抗的作用等[16]。此外，癌症中的微小RNA在肺癌的发生中也具有重要作用[17]。

在分子对接模拟结合力验证中，HMOX1、GSTP1、CDK4与β-谷甾醇、木犀草素模拟结合力较强，提示HMOX1、GSTP1、CDK4基因在鸦胆子治疗肺癌的过程中可能具有重要研究意义。GSTP1是体内重要的致癌物代谢酶基因，在保护正常细胞免受促癌因素的影响以及在抑制细胞癌变中起重要作用[18]。在既往研究表明，激活HMOX1可以参与Janus激酶2/信号传导与转录激活因子3的信号传导，通过促进程序性死亡受体1及其配体的表达以及细胞之间的相互作用来削弱CD8+T淋巴细胞的细胞毒性，从而促进肿瘤细胞的增殖[19]。在很多癌症中，细胞周期蛋白D-CDK4/6-CDK4抑制物-Rb通路的失调可以促进肿瘤细胞的增殖；而鉴于CDK4/6活性在癌细胞中的重要性，CDK4/6抑制剂已成为一种很有前途的肿瘤治疗候选药物[20]。

目前，现代医学对于治疗肺癌的方法仅局限于主流的化疗和靶向药物。因此，探索有效治疗肺癌且天然、高效、副作用小的药物是当今医药界研究的热点。本研究初步探讨了鸦胆子治疗肺癌的作用机制，从分子水平分析了中医药治疗疾病的具体作用机制，为现代中药的开发提供了科学基础。但是本研究仅基于系统药理学探讨了鸦胆子对肺癌治疗的作用，相关研究结果还需实验研究进一步验证。