基于网络药理学熟地黄治疗帕金森病的作用机制研究▲

李 鹏 刘瑛丽 骆 彤 陈 静 吴 林

(1 山东省济宁市中医院脑病科，济宁市 272100，电子邮箱：luomi0926@163.com；2山东省济宁市第四人民医院药剂科，济宁市 272100；3 广西中医药大学第一临床医学院，南宁市 530000)

帕金森病是一种常见于中老年人的慢性退行性神经系统病变，常以运动症状(静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射异常)和非运动症状(排便困难、失眠、认知功能减退、精神障碍)为临床表现[1-2]。帕金森病的发病机制较为复杂，与黑质多巴胺能神经元退变、路易体形成、胆碱能系统功能异常、纹状体区多巴胺递质减少有关[3-6]。目前尚无治疗特效药，临床多采用多巴胺受体激动剂改善症状,但副作用较大[7]。

熟地黄为玄参科植物地黄的根茎，经加工蒸晒而成，其味甘，性微温，具有滋阴补肾的作用。中医临床常将其用于治疗阴虚血少、劳嗽骨蒸、消渴、耳鸣以及男科、妇科病症。现代药理研究表明，熟地黄含有环烯醚萜、单萜、糖苷、糖类、氨基酸、微量元素和有机酸等多种化合物，可用于改善微循环、促进骨髓造血、抑制肿瘤因子的表达、抗感染、增强免疫等[8]。一项数据挖掘研究结果显示，我国名中医裘昌林拟定的用于治疗帕金森病的305首方剂中，熟地黄的使用频数共23次，仅次于天麻、钩藤、木瓜、萸肉，其中熟地黄-萸肉药对频次大于50次[9]。在中医传承辅助平台进行检索，108首治疗帕金森病的方剂中，使用频次前三的中药从高到低依次为白芍、天麻、熟地黄，熟地黄-白芍、熟地黄-天麻、熟地黄-钩藤、熟地黄-当归等药对出现频率较高[10]。熟地黄在帕金森病中应用较多，其作用机制值得深入探讨。

网络药理学是一门综合中药、疾病、中药-成分-疾病-靶点网络的学科，能够深入探讨中药何种有效成分作用于疾病，以及相关的生物学功能和通路[11]，为中药研究提供了新的方法和方向[12]。因此，本研究运用网络药理学技术探讨熟地黄治疗帕金森病的作用机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 熟地黄有效成分的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以“熟地黄”为关键词搜索其全部活性成分。然后根据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%，药物类药性(drug likeness,DL)>0.18筛选有效活性成分[16]。

1.2 中药靶点的获取 在中药系统药理学数据库与分析平台中，以“熟地黄”为关键词进行搜索，选择“Related Targets”一栏，将结果导出，并通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)查询其蛋白所对应的基因，并用Perl 5.26.3 软件(https://www.perl.org/get.html)对筛选出的靶点基因进行注释，去除重复项后获得最终的中药作用靶点。

1.3 疾病相关基因的获取 分别在 GeneCards 数据库(https://genealacart.genecards.org/)、OMIM 数据库(https://www.omim.org/)中输入“Parkinson′s disease”，对帕金森病相关的靶点基因进行检索，导出结果。通过去除重复项，汇总后建立疾病基因的数据集。

1.4 中药靶点和疾病靶点交集的获取 所得数据导入R×64 3.6.2软件(https://www.r-project.org/)，采用相应脚本运算，得出帕金森病相关靶点和熟地黄作用靶点的交集，即中药-疾病靶点，并绘制韦恩图。

1.5 中药-有效成分-疾病-靶点调控网络的构建 利用Perl 5.26.3软件将熟地黄作用的靶点和中药-疾病靶点进行一一映射，然后运用Cytoscape 3.7.2软件(https://cytoscape.org/)对该网络进行拓扑计算，得到中药-成分-疾病-靶点调控网络。

1.6 中药-疾病靶点蛋白相互作用网络的构建与核心基因的筛选 利用STRING 11在线软件(https://string-db.org/)将中药-疾病靶点输入软件Multiple Proteins列表下的“List of Names”中，在“Organism”中选择“homo sapiens”，保存结果文件。将所得文件输入 R×64 3.6.2软件进行计算，得到蛋白互作网络核心靶点的条图。

1.7 中药-疾病靶点的功能富集分析和通路富集分析 利用 R×64 3.6.2软件进行计算，对熟地黄治疗帕金森病的核心靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO) 功能富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 通路富集分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 熟地黄有效成分的筛选和靶点预测结果 共搜索到熟地黄的活性成分76个，根据OB 和DL进行筛选，共获得有效活性成分2个，包括β-谷甾醇(Mol编码为MOL000359，OB=36.91%，DL=0.75)和豆甾醇(Mol编码为MOL000449，OB=43.83%，DL=0.76)。 共得到中药相关靶点327个，去除重复项后获得中药作用靶点26个。

2.2 中药-疾病靶点构建的结果 获得帕金森病相关的靶点7058个，取交集后得到中药-疾病靶点共19个，见图1。

图1 中药-疾病靶点的韦恩图

2.3 中药-有效成分-疾病-靶点调控网络的构建结果 构建的调控网络(图2)中红色椭圆形代表帕金森病，绿色菱形代表中药熟地黄，黄色三角形代表熟地黄有效成分豆甾醇，紫色V形代表中药-疾病靶点，即熟地黄主要通过豆甾醇作用于19个靶点，这19个靶点可能影响帕金森病的发生和发展。

图2 中药-成分-疾病-靶点调控网络

2.4 中药-疾病靶点蛋白相互作用网络以及核心基因的筛选结果 中药-疾病靶点蛋白相互作用网络见图3。由图 4 可知，中药-疾病核心基因按邻接节点数目由多到少依次为MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2、ADRA2A、ADRB2、CHRM1、SLC6A3、ADRB1、CHRM2、CHRM3、PTGS2、ADHIC、AKR1B1等。邻接节点数目越多，成为核心基因的概率越大，故MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2很有可能成为核心基因。

图3 中药-疾病靶点蛋白相互作用网络

图4 中药-疾病核心靶点的条图

2.5 GO功能富集分析结果 共富集到65条生物过程，熟地黄治疗帕金森病的核心靶点的 GO 功能主要涉及G蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体活性、儿茶酚胺结合、G蛋白偶联神经递质受体活性、神经递质受体活性、乙酰胆碱受体活性、G蛋白偶联、5-羟色胺受体活性等，见表1、图5。

表1 GO富集分析部分结果

图5 GO功能富集分析柱状图 (前20个)

2.6 KEGG通路富集分析结果 共富集出27条通路与熟地黄治疗帕金森病有关，主要包括神经活性配体-受体相互作用通路、钙信号通路、唾液分泌通路、脂肪细胞脂解的调节通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导通路、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信号通路、5-羟色胺能突触通路、药物代谢-细胞色素P450通路、组氨酸代谢通路、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信号通路、多巴胺能突触通路、胆碱能突触通路等，见表2和图6。 钙信号通路、 cGMP-PKG 信号通路、cAMP信号通路分别见图7～9。

表2 KEGG 通路富集分析结果(前20个)

图6 KEGG 通路富集分析柱状图

图7 钙信号通路

图8 cGMP-PKG 信号通路

图9 cAMP信号通路

3 讨 论

帕金森病属中医“颤证”范畴,别名“颤振”“震颤”“振掉”。中医临床常将颤证分为肝肾阴虚型、肝风内动型、风痰阻络型、气血亏虚型4型[17-18]。颤证病位在脑，年老体弱是病因，而肾虚是根本[19]。熟地黄归肝、肾经，可以滋阴补肾，适合肝肾阴虚型的帕金森病患者。

由中药-成分-疾病-靶点调控网络图可知，豆甾醇是熟地黄治疗帕金森病的主要有效成分。植物甾醇类具有抗神经性退化、抗氧化、抗衰老、抗动脉粥样硬化等作用，豆甾醇属于植物甾醇类中的一种。豆甾醇能通过大脑血流屏障,抑制氧化应激反应，提高线粒体跨膜电位和ATP量，从而减轻帕金森病患者的神经元变性[20]。

根据中药-疾病靶点蛋白相互作用网络和核心靶点条形图，MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2有可能是熟地黄发挥抗帕金森病作用的核心基因。MAO是人体内的能够催化单胺类物质氧化脱氨反应的酶，包括MAOA和MAOB两种同工酶。其中，MAOA主要分布在儿茶酚胺能神经元中，可使单胺类神经递质(如去甲肾上腺素、5-羟色胺)失活[21]。MAOA表达上调与抑郁症密切相关[22]，而部分帕金森病患者有不同程度的抑郁表现。MAOB主要分布在神经元(组胺能、5-羟色胺能)与神经胶质细胞中，MAOB的抑制剂有司来吉兰、雷沙吉兰、沙芬酰胺等[21]。MAOB的水平越高，帕金森病发病越严重，而MAOB抑制剂能治疗早期帕金森病，延缓病情进展。ADRA1A 是肾上腺素能系统中可介导肾上腺素和去甲肾上腺素发挥生物学功能的生物传感器[22]。ADRA1A基因和广泛性焦虑障碍密切相关[23]，较多帕金森病患者存在焦虑障碍，而熟地黄可能通过调控ADRA1A水平改善帕金森病患者的焦虑症状。ADRA1B属于G蛋白偶联受体家族,在激活有丝分裂以及调节细胞的生长和增殖中发挥主要作用[24]，但目前尚无针对ADRA1B与帕金森病之间确切关系的研究报道，值得进一步探讨。SLC6A2为去甲肾上腺素转运体，对调控去甲肾上腺素的表达和终止神经冲动信号，保持受体对神经递质的敏感性具有关键的作用[26-27]。去甲肾上腺素转运体和多巴胺转运体、5-羟色胺转运体具有很高的序列同源性,而后两者与帕金森病的发病密切相关,故作用于去甲肾上腺素转运体很可能能改善帕金森病患者的症状。

GO功能分析结果，熟地黄治疗帕金森病的核心基因可通过影响G蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体活性、儿茶酚胺结合、G蛋白偶联神经递质受体活性、神经递质受体活性、乙酰胆碱受体活性、G蛋白偶联5-羟色胺受体活性等，来调控帕金森病的发生，即主要从神经递质、乙酰胆碱、G蛋白偶联等分子水平来治疗帕金森病。本研究共富集出27条通路与治疗帕金森病有关，其中包括钙信号通路、cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路等。钙离子是真核细胞中重要的第二信使[28]，对神经传导、基因转录及信号通路传导等有重要作用，钙信号通路与帕金森病、阿尔兹海默病等神经性疾病发病密切相关[29]。研究表明，给予帕金森病小鼠注射钙离子通道拮抗剂尼莫地平，能明显改善小鼠的运动过缓、肌强直、静止性震颤行为学异常[30]；高血压病患者使用钙离子拮抗剂治疗，可明显降低帕金森病发病风险[31]。以上研究结果均说明钙离子拮抗剂能够保护帕金森病，而熟地黄治疗帕金森病的作用之一则是通过钙信号通路。 GMP和NO、8-Br-c 可增加细胞内cGMP的水平，发挥抗神经元凋亡的作用[32]；而血管钠肽通过激活cGMP/PKG信号通路，起到保护多巴胺能神经元作用[33]。但目前尚无研究表明熟地黄何种成分能促进血管钠肽的释放，从而激活cGMP/PKG信号通路，起到保护多巴胺能神经元。

综上所述，熟地黄通过豆甾醇作用于帕金森病，体现了多靶点、多途径治疗帕金森病的特点，为熟地黄的临床及实验研究提供理论依据，为帕金森病的治疗提供新方向，今后应从临床和实验多方面进一步验证。