妊娠期高血压对大鼠肝脏Ⅰ型脱碘酶及甲状腺激素的影响研究*

刘韵璐 王 洋

(1. 四川省医学科学院，四川省人民医院实验动物研究所，成都 610000)(2. 成都市双流区妇幼保健院，成都 610000)

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy, HDCP) 是妊娠期特有的疾病，报道显示[1]，该病在我国的发病率为9.4%～10.4%，是导致孕产妇死亡的最主要原因。HDCP以妊娠20周后出现高血压、尿蛋白为主要特征，与甲状腺功能减退的临床表现类似，相关临床研究表明[2-4]，HDCP与甲状腺激素功能的改变密切相关，可能参与并促进了甲状腺功能减退的发生、发展。目前，对于HDCP如何影响甲状腺功能改变的机制尚不明确，相关研究大多限于临床分析，还缺乏有力的基础实验研究依据。碘化甲状腺氨酸脱碘酶(iodothyronine deiodinases, DI)由三种含硒整合膜蛋白组成，能特异性调节组织和细胞中的甲状腺激素水平。循环血液中活性强大的T3主要是由肝脏中的Ⅰ型脱碘酶(DIO-Ⅰ)催化T4转化生成[5]，研究HDCP状态下DIO-Ⅰ的基因水平的表达有助于进一步解释HDCP参与甲状腺功能紊乱的机制。因此，本研究通过建立妊娠期高血压疾病大鼠模型，观察HDCP对大鼠肝脏中DIO-Ⅰ的表达及血甲状腺激素的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选择体质量280～300 g SPF级雌性SD大鼠20只，体质量330 g～350 g SPF雄性大鼠10只，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：0001133。动物于SPF级屏障系统饲养，环境温度20～24 ℃，相对湿度：40%～70%，12 h/12 h明暗交替，实验动物使用许可证号：SYXK[川]2018-058。

1.1.2试剂及仪器

亚硝基左旋精氨酸甲酯(nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，美仑生物，中国；Trizol, Invitrogen，美国; RNA反转录试剂盒，ABM公司，中国；SYBR Green 1荧光染料试剂盒，GeneCopoeia公司，美国；DIO-Ⅰ、GAPDH引物，Invitrogen，美国；TT3、TT4、FT3、FT4 ELISA检测试剂盒，Elabscience，中国; BP-6 A无创血压测量系统，成都泰盟科技有限公司; Quant Studio 6 Flex 实时荧光定量PCR仪、Mini Amp PCR仪，Applied Biosystems;KHBST-360酶标仪，上海科华实验系统有限公司。

1.2 方法

本实验方案经四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所伦理委员会审查通过，批件编号：伦审2019第001号。

1.2.1动物分组：根据大鼠体质量按均衡随机分组法将发情期大鼠雌性和雄性大鼠以2∶1合笼过夜，次日清早用生理盐水蘸湿棉签进行阴道涂片，镜下观察若有精子视为妊娠第1天[6]。将孕鼠称重编号，随机分为正常妊娠对照组(n=10)和妊娠高血压模型组(n=10)。

1.2.2造模方法：自妊娠第13天开始，模型组孕鼠皮下注射L-NAME 250 mg/kg·d-1，至妊娠第21天。对照组孕鼠皮下注射生理盐水，注射体积和天数与模型组一致。两组孕鼠均于妊娠第11天起，每日用BP-6A无创血压仪监测尾动脉血压；并用代谢笼收集孕鼠妊娠第12、15、17、20天24 h尿液，应用考马斯亮蓝法进行24 h尿蛋白定量检测。当模型组与对照组比较，血压和尿蛋白显著性高于对照组(P<0.05)，且伴动作迟缓、懒动等行为学指标改变时，视为造模成功。

1.2.3肝脏DIO-Ⅰ表达检测：两组孕鼠妊娠第21天，用5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，①取孕鼠肝脏左叶，PBS缓冲液冲洗周围血污，置于液氮中冻存。②检测当日，取研磨后的冻存肝脏100 mg，应用Trizol试剂盒提取RNA，采用变性琼脂糖凝胶电泳对提取RNA进行验证。③按照RNA反转录试剂盒说明书进行RT，合成cDNA。④将所有cDNA样本分别配置实时定量PCR反应体系，体系配置如下：SYBR Green 1荧光染料10 μL，上游引物1 μL, 下游引物1 μL，dNTP 1 μL，Taq聚合酶2 μL，待测样本cDNA 5 μL，ddH2O 30 μL；将配置好的PCR反应溶液置于实时定量荧光PCR仪上进行PCR扩增反应，每个反应做3个复孔。⑤反应条件如下：预变性，95 ℃，30 s，共做1个循环；PCR反应，95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，共做40个循环；熔解反应，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。⑥引物设计软件Primer Premier5.0，内参基因GAPDH和DIO-Ⅰ基因引物序列见表1。⑦所有复孔均取平均值进行计算，以内参基因的表达量对结果进行标准化。

表1 PCR引物

1.2.4血液甲状腺激素检测：两组孕鼠妊娠第21天，用5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，将孕鼠仰卧固定于操作台，分离腹主动脉，用真空采血管采集动脉血，3 000 r/min离心10 min，收集上清液储存于-80 ℃。检测当日，用ELISA试剂盒法检测孕鼠血清中TT3、TT4、FT3、FT4的浓度。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 两组大鼠肝脏DIO-Ⅰ基因表达比较

妊娠高血压孕鼠肝脏中DIO-Ⅰ基因表达水平，较正常妊娠对照组，显著下降(P<0.05)。见图1。

图1 实时荧光定量PCR检测DIO-Ⅰ基因相对表达水平比较

2.2 两组大鼠甲状腺激素水平比较

与正常妊娠对照组比较，妊娠高血压模型组大鼠TT3、FT3值显著下降(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清甲状腺激素水平比较

3 讨论

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy, HDCP)是妊娠期妇女特有又常见的疾病，以不同程度的高血压、蛋白尿、水肿等为主要临床特征[7]，其致病机制尚不明确，是导致孕产妇死亡的主要原因。HDCP积累全身多个脏器[8]，其与甲状腺功能改变的密切联系已被诸多临床研究[9-11]所证实。但HDCP是通过哪些途径影响到甲状腺功能，其影响机制如何，尚不明确。而目前基于患者的临床研究不仅在研究深度和广度上都存在局限性，其研究方法在伦理和方法上也受到限制，基于此，本课题组参考相关文献报道[12-14]，通过皮下注射L-NAME构建了稳定的HDCP大鼠模型，应用实时荧光定量PCR技术研究了HDCP时肝组织中脱碘酶在基因表达水平上的改变，并结合血液中甲状腺激素水平的改变，探讨了HDCP对甲状腺功能影响的可能机制，为该疾病的诊治提供了可靠的实验依据。

人体中一共存在3种脱碘酶，分别为Ⅰ型脱碘酶(DIO-Ⅰ)、Ⅱ型脱碘酶(DIO-Ⅱ)、Ⅲ型脱碘酶(DIO-Ⅲ)，3种酶在不同部位和环节发挥脱碘作用，以调节甲状腺激素的生物活性[15]。其中DIO-Ⅰ主要存在于肝脏中，是外周组织中T4向T3转换的关键酶，研究表明[16-17]，除少量T3是由甲状腺直接分泌入血，机体中75%～80%发挥作用的T3是由T4在DIO-Ⅰ作用下脱碘合成，DIO-Ⅰ在甲状腺激素代谢和功能中发挥着至关重要的作用。本研究观察到，妊娠高血压疾病模型组大鼠肝脏中的DIO-ⅠmRNA的表达显著下降，相应的，其血清中TT3和FT3的水平也显著降低。究其原因，可能是由于HDCP时，全身微小血管痉挛，各脏器局部灌流减少，导致肝脏成为HDCP的慢性攻击靶器官[18-19]，使DIO-Ⅰ基因表达受到影响，外周T4脱碘效率下降，T3生成降低。此外，由于受妊娠期雌激素的影响，使得血液中甲状腺素结合球蛋白(TBG)维持在正常范围内[20]，而T4释放入血后，一部分T4与TBG结合，与血液中发挥生物活性的游离型T4相互转换，使血液中T4达到动态平衡。T3则与TBG亲和力小，主要以游离形式存在，其浓度水平主要受DIO-Ⅰ的影响[21]，因此导致了本研究模型组大鼠血液中TT3、FT3下降最为明显，而TT4、FT4水平改变不明显的结果。

综上，本研究结果显示，HDCP能通过降低肝脏DIO-Ⅰ基因表达水平，改变外周甲状腺激素代谢情况，从而影响甲状腺激素水平，但HDCP通过哪些途径来调控DIO-Ⅰ的表达，影响DIO-Ⅰ的活性，还有待进一步研究。