6种常用消毒剂对不同细菌消毒效果的比较

梁锦宁 李家富 欧阳轶强 张名媛 孙俊铭 郭晓萍

(广西医科大学实验动物中心，南宁 530021)

随着实验动物行业的迅猛发展，行业内对高质量动物的期望与需求与日俱增。实验动物生存环境是影响实验动物质量以及与实验动物有关的食品药品检定和安全评价实验结果准确可靠的重要因素[1]。我国于2010年发布了现行的实验动物环境及设施国家标准GB14925-2010，为实验动物环境和设施制定了严格的标准。因此，为动物实验提供优质、安全、稳定、无污染的设备和饲养环境是非常必要的，而对饲养环境的监测是保障实验动物环境的重要手段之一[2]。

动物设施在实际运行中每时每刻都面临着来自人员、动物、物品进出的污染风险，消毒是切断传播途径、预防传染病发生和控制疾病传播的一项重要的防疫措施，因此，实验动物环境和设施的常规消毒显得尤为重要。为确保屏障工作正常运行，需要对屏障环境进行长期、定期的消毒监测，确保SPF级实验动物屏障内无特定病原微生物感染。本实验收集分离得到的沙门氏菌和大肠杆菌，对其进行抑菌实验，为消毒剂的科学使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种:沙门氏菌、大肠杆菌，菌种均为实验动物中心检测分离获得的菌株。

1.1.2试剂和溶液:0.2%过氧乙酸，0.1%二氯异氰脲酸钠粉(有效氯40%)，0.25%戊二醛溶液，0.25%新洁尔灭，0.05%百毒杀(癸甲溴铵溶液)，0.05%古迪安(戊二醛癸甲溴铵溶液)。

1.1.3仪器及其它器材:无菌培养皿，无菌滤纸片，无菌镊子，恒温培养箱，酒精灯，高压蒸汽灭菌锅，烧杯，量筒，移液管，三角涂棒。

1.1.4培养基:营养琼脂培养基，LB液体培养基。

1.2 方法

1.2.1培养基的配制:营养琼脂培养基：称取33 g营养琼脂，加入1 000 mL蒸馏水搅拌加热至溶解；LB液体培养基：胰蛋白胨2.5 g，酵母粉1.25 g，氯化钠2.5 g完全溶解于200 mL超纯水中，定容至250 mL加NaOH调至pH 7.4，高压灭菌备用。

1.2.2高压蒸汽灭菌:上述培养基，培养皿，滤纸片，移液管，蒸馏水等以0.1 MPa、121 ℃、30 min高压蒸汽灭菌。

1.2.3制作培养平板:将已灭菌并冷却至45～50 ℃的营养琼脂培养基倾入培养皿中约12～15 mL，水平放置至凝固。

1.2.4配菌悬液:将沙门氏菌和大肠杆菌转接至LB液体培养基上，37 ℃，200 r/min 摇床上振荡24 h。

1.2.5制作含菌培养基:用无菌移液管吸取200uL菌悬液分别加入到营养琼脂平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。

1.2.6消毒剂及纸片处理:按消毒剂的配比浓度配制消毒剂，用无菌镊子将已灭菌的小圆形滤纸片(D8mm)分别浸入装有各种消毒剂溶液的烧杯中完全浸湿(纸片全部沉底)取出滤纸片时保证滤纸片所含的消毒剂溶液量基本一致，并沥去多余的药液。无菌操作将滤纸片贴在平板中心位置，轻轻按压，使药片与培养基密切接触。用浸有无菌水的滤纸片作为对照，每种消毒剂做3个重复。

1.2.7培养:将平板倒置于37 ℃生化培养箱中培养24 h。

1.2.8结果观察:观察抑菌圈，并记录抑菌圈的直径(含滤纸片的直径)。根据抑菌圈的大小，判断抑菌、杀菌作用。

2 结果

2.1 化学消毒剂对沙门氏菌抑菌效果分析

6种消毒剂对沙门氏菌抑菌效果见表1,0.05%古迪安对沙门氏菌作用效果最显著，其次是0.05%百毒杀和0.25%戊二醛溶液，0.2%过氧乙酸、0.1%二氯异氰脲酸钠粉和0.25%新洁尔灭抑菌效果较差。6种消毒剂对沙门氏菌的抑菌效果显著性的比较见表2，0.05%古迪安和0.05%百毒杀对沙门氏菌的抑菌作用效果相对于0.2%过氧乙酸、0.1%二氯异氰脲酸钠粉、0.25%戊二醛溶液、0.25%新洁尔灭差异显著(P<0.05)；0.1%二氯异氰脲酸钠粉对沙门氏菌的抑菌作用效果相对于0.2%过氧乙酸、0.25%戊二醛溶液、0.25%新洁尔灭差异不显著(P>0.05)。0.25%戊二醛溶液对沙门氏菌的抑菌作用效果相对于0.25%新洁尔灭差异显著(P<0.05)。0.2%过氧乙酸对沙门氏菌的抑菌作用效果相对于0.25%戊二醛溶液、0.05%百毒杀和0.05%古迪安差异显著(P<0.05)。

表1 6种消毒剂对沙门氏菌抑菌效果

表2 6种消毒剂对沙门氏菌的抑菌效果显著性的比较

2.2 化学消毒剂对大肠杆菌抑菌效果分析

6种消毒剂对大肠杆菌抑菌效果见表3，0.05%古迪安对大肠杆菌的抑菌作用效果最显著，其次是0.25%戊二醛溶液和0.05%百毒杀，0.1%二氯异氰脲酸钠粉，0.2%过氧乙酸和0.25%新洁尔灭抑菌效果较差。6种消毒剂对大肠杆菌的抑菌效果显著性的比较结果见表4，0.1%二氯异氰脲酸钠粉与0.25%戊二醛溶液、0.05%百毒杀对大肠杆菌的抑菌效果的比较差异不显著(P>0.05)；0.1%二氯异氰脲酸钠粉与0.2%过氧乙酸、0.25%新洁尔灭、0.05%古迪安对大肠杆菌的抑菌效果的比较差异显著(P<0.05)。0.05%百毒杀与0.2%过氧乙酸、0.1%二氯异氰脲酸钠粉、0.25%戊二醛溶液、0.25%新洁尔灭、0.05%古迪安对大肠杆菌的抑菌效果的比较差异不显著(P>0.05)；0.05%古迪安与0.2%过氧乙酸、0.1%二氯异氰脲酸钠粉、0.25%新洁尔灭相比较差异显著(P<0.05)；0.05%古迪安与0.25%戊二醛溶液、0.05%百毒杀比较差异不显著(P>0.05)；

表3 6种消毒剂对大肠杆菌抑菌效果

表4 6种消毒剂对大肠杆菌的抑菌效果显著性的比较

3 讨论

实验动物生存环境和设施是影响实验动物质量的关键因素之一，提高实验动物环境和设施的安全，为动物实验提供合格的实验动物是实验动物中心的使命。实验动物中心很多环节需要消毒处理，各个环节使用的消毒液浓度不一样，各科研院所动物中心使用的消毒剂各不相同，对于环境消毒使用较多的有过氧乙酸、过氧化氢[3]、次氯酸、新洁尔灭和百毒杀等等[4]。屏障环境动物实验室在使用过程中的消毒效果直接影响环境微生物的有效控制。然而，人们日常使用消毒剂时一般参照厂商说明书使用，而厂商一般仅根据环境及消毒环境推荐不同的消毒浓度，不会根据致病菌的不同而推荐不同的消毒浓度，消毒效果在不同情况下存在明显差异。而且，在同一个环境或者同一个地方长期使用同一种消毒剂，细菌会产生耐药性导致消毒效果下降[5]。因此，有必要对常见致病菌的消毒剂的耐受性进行相关研究，为消毒剂的科学使用、合理使用提供重要参考价值。

百毒杀消毒剂的有效成分是癸甲溴铵，具有广谱、高效、低毒，刺激性小，对金属腐蚀性小，对病毒和真菌等都有杀灭作用，适用于带动物消毒及用具、环境的消毒[6]。古迪安消毒剂的有效成分是戊二醛癸甲溴铵溶液，有刺激性气味。戊二醛为醛类消毒药，可杀灭细菌的繁殖体和芽孢、真菌、病毒[7]。新洁尔灭是一种阳离子表面活性剂，有广谱抑菌杀菌作用，作用快，毒性和刺激性小，对病毒和芽孢作用弱，常用于皮肤和器械的浸泡消毒[8]。二氯异氰脲酸钠粉是一种含氯消毒剂，是一种高效、广谱、新型内吸性杀菌剂，有极强的杀菌作用。二氯异氰脲酸钠化学性质稳定，便于贮存运输；使用安全、简便、用量少、药效持续时间长，是一种性能稳定的强氧化剂和氯化剂。在实际应用过程中，我们必须综合考虑各种消毒剂应用范围，如动物饲养量、是否带动物消毒、对动物的刺激性、对设施设备的腐蚀性、是日常消毒还是爆发疫病时消毒、是饲养环境消毒还是实验用具的消毒等。

一般情况下，消毒剂浓度越高，其抑菌效果越好，但并非越高越好，且频繁使用高浓度消毒剂消毒，可能会导致致病菌抗性的增强，从而使消毒剂失效[9]。因此，我们在实际应用过程中，要多方面考虑选择合适的消毒剂浓度。本研究选择二氯异氰脲酸钠粉、戊二醛消毒液、新洁尔灭、百毒杀和古迪安6种不同消毒剂对沙门氏菌和大肠杆菌进行耐受测试，以期筛选出对沙门氏菌和大肠杆菌杀毒效果最理想的消毒剂。本研究结果显示0.05%古迪安对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌作用最强，0.05%的百毒杀对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌作用次之，0.25%戊二醛溶液对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果较好，0.2%过氧乙酸、0.1%二氯异氰脲酸钠粉和0.25%新洁尔灭对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果较差。我们的实验结果显示按照二氯异氰脲酸钠粉和新洁尔灭说明书推荐的使用浓度并不能达到理想的消毒效果，说明沙门氏菌和大肠杆菌对二氯异氰脲酸钠粉和新洁尔灭的耐受性较高，消毒效果较差。由于古迪安和百毒杀使用频率较低，对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果较为理想。

通过不同消毒剂对沙门氏菌和大肠杆菌抑菌效果的比较，二氯异氰脲酸钠粉和新洁尔灭的灭菌效果不理想，可能与长期使用产生耐药性有关，我们筛选出古迪安和百毒杀这两种有效的杀毒剂可供今后屏障环境消毒提供参考。