生物样品中多肽定量分析方法

韩宁娟，方欢乐，刘建利

（1.西安培华学院医学院，陕西西安 710125；2.西北大学生命科学院，陕西西安 710065）

肽类药物在自然界中广泛存在，一般都含有3～50个主要氨基酸。其中，氨基酸残基数小于15的被称为小分子肽。这些肽在各种生物系统中起着重要作用，参与细胞分化、神经递质调节和肿瘤疾病的发生[1]。肽类药物在体内的代谢非常复杂，生物体中还存在着内源性的物质干扰，同时这类药品的用剂量较小，体液中药物浓度很低，这就要求检测方法有较高的灵敏度和特异性。目前，生物样品中肽类药物检测的方法主要有生物检查法、免疫检验法、同位素标志示踪法以及色谱等。本文从生物样品处理、定量分析方法的特点两方面综合论述近年来的研究成果。

1 生物样品的预处理方法

常见生物样本有血浆、血清、尿液、唾液及组织等。小分子肽的理化性质介于小分子化药与大分子蛋白质之间，生物样品中经常含有与小分子肽结构相似的其他多肽类物质（内源性物质），进行色谱分析时会堵塞色谱柱，或干扰目标物的分析。因此，分析时需对样品进行预处理，减少对系统的污染，提高分析结果的准确度和精密度，同时可延长色谱柱寿命，改善色谱组分行为。目前，国内外对生物样品预处理的方法主要有蛋白沉淀法、液液萃取法和固相提取等。

1.1 蛋白沉淀法

蛋白沉淀法是利用盐析方法通过降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚从溶液中沉淀析出的一种方法。通过沉淀蛋白，不仅可以释放结合到血浆蛋白中的药物，从而达到提纯待测组分的目的，也可测定药物的总浓度，还能够预防提取过程中蛋白质发泡引起的乳化，保护分析仪器，延长使用寿命。常用的沉淀蛋白质的溶剂有甲醇、乙腈、三氯乙酸等。一般进行蛋白沉淀有机溶剂的体积是样品体积的数倍（最少2～3倍），经过高速离心后吸取上清液直接进样分析或稀释后进样分析。

1.2 液液萃取法

液液萃取是一种经典的萃取方法，利用目标物在溶剂中溶解度或分配系数上的差异达到分离提取目标物的目的。在选用萃取溶剂时，利用相似相溶原则，对于非极性组分的样品，可以以水为基质，用与水互不相容的有机溶剂进行提取，防止带入水溶性杂质，且需满足无毒、沸点低、易挥发和浓缩的条件。另外，液液萃取容易发生乳化现象。该方法优点是回收率高、成本低，易去除无机盐和磷脂，基质效应较小；缺点是比较费时费力、有机溶剂消耗量大，对环境污染大，不容易实现自动化以及容易丢失被测组分等。

1.3 固相萃取法

固相萃取法是基于被测组分在流动相与固定相之间分配系数不同而实现的。将被测组分吸附在固定相上，再选择适当的溶剂冲去杂质，再用被测物质溶解度好的溶剂进行冲洗。操作时，可选用在负压、正压和常压下完成。负压下是有机溶剂挥发较易，有时待测物质会丢失；正压能缩短样品的处理时间，但若加的压力太大会导致溶剂流速变快，使分离效率降低；常压操作费时，使用较少。固相萃取的优点是回收率高、选择性好、效率高，但耗材费用高，也容易堵塞萃取柱。

2 分析方法

目前，检测生物样本中的小分子肽有生物检定法、酶联免疫检查法、放射免疫分析、电化学光谱和液质联用等分析方法。液质联用色谱法是多肽分析的常用方法之一；其余方法都是基于抗体分析/抗原特定性识别，对目标多肽进行定量分析，属于结合配体分析方法，是多肽药物分析的最常用方法。

2.1 配体结合分析法

配体结合分析法是检测多肽的一种常用方法，是基于抗体分析/抗原特定性识别的一种定量分析目标多肽的方法，主要包括酶联免疫检测法、放射免疫分析、电化学发光法等。

2.1.1 酶联免疫检测法

酶联免疫检测法是将被试药物视为抗原，与标记的抗体形成一种抗原-抗体复合物，最后加入酶标底物。药物抗原需要抗体才能识别，其方法有一定的特异性。该方法具有操作简单、快速、灵敏度高、无放射性危害等优点，但不能区分药物活性和无活性形式，原型药物及其代谢物。LINDSTR等[2]用ELISA法检测人血浆中缓激肽，检测范围为0.1～1 000 nmol/L。

2.1.2 放射免疫分析法

放射免疫分析法是一种用同位素检测的高敏度免疫抗原-抗体相结合的特殊反应。Erb等[3]通过电化学发光免疫检测法确定血清素水平，并通过放射免疫检测法确定血浆中西曲瑞克的浓度。周杏琴等[4]建立了放射免疫分析法检测人血浆中特立帕肽，检测浓度范围10～1 280 pg/mL。

2.1.3 电化学发光

电化学发光是化学发光方法和电化学方法相结合，通过电化学方法产生一些特殊的物质，电生物质之间或电生物质与其他物质之间进一步反应而产生的一种发光现象，该方法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单等优点。

陈超等人[5]建立了一种定量测定人血清中胰岛素的化学发光免疫方法，并进行了方法学评价，结果表明该方法的线性范围在0～300 μIU/mL，最低检测限可达0.08 μIU/mL。

2.2 色谱法

2.2.1 荧光试剂衍生化测定法

荧光分析法是利用物质发射荧光的特性，对物质进行分析的光学分析法，比紫外检测器的灵敏度高。若多肽类药物在紫外检测器下灵敏度低，无法进行体内分析，可与荧光试剂衍生化后，进行荧光检测。

徐鹏遥等[6]用4-(N-马来酰亚胺)苯基三甲基碘化铵作为衍生化试剂，对血浆样品进行衍生化处理后，采用高效液相色谱法-质谱法测大鼠血浆中谷胱甘肽的含量，并进行了方法学验证，衍生后谷胱甘肽定量下限为10 pmol/L。

2.2.2 液质联用分析（LC-MS）

液质联用由液相色谱与质谱两部分组成，采用色谱分离物质，再由质谱将化合物形成的离子和碎片离子，按荷质比进行分离检测。该方法能够探测到化合物分子量和结构的相关信息，用于定性和定量分析，但多肽类药物易吸附于容器壁、吸管端及LC-MS系统中，导致样品损失，使得仪器灵敏度降低。因此，在采用液质联用时要注意容器的材料、肽类结构，还要注意溶液的浓度、pH、温度和离子强度等。

Everaert等[7]建立了LC-MS法检测人血浆和尿液中痕量鹅肌肽，并进行了方法学验证，在人血浆中检测浓度范围为5～500 μmol/L，人尿液中鹅肌肽的浓度为 0.5～100 μmol/L。

2.3 其他方法

二维凝胶电泳-质谱法、高效毛细管电泳-质谱联用、同位素标记技术等也逐步运用在生物样品中多肽类药物分析中。

3 结语

在多肽药物生物样品的分析过程中，对于抗体试剂容易获得的多肽类药物，配体-抗体检测法是生物样品的首选方法；对于不易得到的抗体试剂，液质联用法可以满足定量分析。鉴于多肽类药物的特殊性，需要综合运用生物学、免疫学及理化分析等方法才能得到比较可靠的结果，更加准确、简便的在线仪器联用技术将成为今后的主要发展方向。